FRET-basierten Reporter werden immer häufiger eingesetzt, um Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten in lebenden Zellen zu überwachen. Hier beschreiben wir eine Methode auf, wie FRET-basierten Reporter nutzen, um den Zellzyklus-abhängige Veränderungen in Ziel-Phosphorylierung zu beurteilen.
Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basierten Reportern 1 erlauben die Beurteilung der endogenen Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten in lebenden Zellen. Solche Sonden bestehen typischerweise aus Varianten von GFP und YFP, durch eine phosphorylierbaren Sequenz und einer phospho-bindende Domäne eingegriffen. Nach der Phosphorylierung FRET der Sonde ändert Konformation, die zu einer Veränderung des Abstandes oder der Orientierung zwischen CFP und YFP Ergebnisse, die zu einer Veränderung der Effizienz (Abb. 1). Mehrere Sonden haben in den letzten zehn Jahren veröffentlicht worden, die Überwachung der Aktivität Balance mehrerer Kinasen und Phosphatasen, darunter Reporter von PKA 2, PKB 3, PKC 4, PKD 5, ERK 6, JNK 7, Cdk 18, Aurora B 9 und Plk1 9 . Angesichts des modularen Aufbaus sind zusätzliche Sonden wahrscheinlich in naher Zukunft 10 austreten.
Progression durch den Zellzyklus wird durch Stress signali betroffenng Wege 11. Bemerkenswert ist, dass der Zellzyklus unterschiedlich während ungestörte Wachstum im Vergleich zu, wenn die Zellen vor Stress erholt 12 geregelt. Zeitraffer-Bildgebung von Zellen durch den Zellzyklus erfordert daher besondere Vorsicht. Dies wird zu einem Problem vor allem beim Einsatz ratiometrische Bildgebung, da zwei Bilder mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis erforderlich sind, um richtig zu interpretieren die Ergebnisse. Ratiometric FRET Bildgebung von Zell-Zyklus abhängig Veränderungen im Bereich der Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten vorwiegend muss Teilbereiche des Zellzyklus 8,9,13,14 beschränkt.
Hier diskutieren wir eine Methode zur FRET-Sonden mit ratiometrische Bildgebung in der gesamten menschlichen Zellzyklus kontrollieren. Die Methode stützt sich auf die Einrichtungen, zur Verfügung zu viele Forscher in den Biowissenschaften ist und erfordert keine Fachkenntnisse der Mikroskopie oder Bildverarbeitung.
Überwachung FRET während des Zellzyklus erfordert Überlegungen, die weniger wichtig sind bei der Beurteilung der kurzfristigen Reaktionen auf äußere Reize. Zuerst wird das Fortschreiten des Zellzyklus leicht gestört durch Stress-Signalisierung, verlangen, dass Phototoxizität auf ein Minimum gehalten wird. Zweitens können alle Reporter möglicherweise beeinflussen zelluläre Prozesse durch Titration aus Kinasen, Phosphatasen oder Interaktion Domains. Der wohl einfachste Weg, um zu beurteilen, wenn die experimente…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren sind vom schwedischen Forschungsrat, die Schwedische Stiftung für strategische Forschung, dem schwedischen Cancer Society, der schwedischen Kinder-Krebs-Gesellschaft, Åke Wibergs Stiftung und Jeanssons Stiftung unterstützt.
Reagent | Catalogue Number | Company |
Leibovitz L-15, no phenol red | 21083-027 | GIBCO, by Life Technologies |
DMEM+Glutamax-I | 31966 | GIBCO, by Life Technologies |
Fetal Bovine Serum (FBS) | SV30160.03 | HyClone |
0.05% Trypsin EDTA | SH30236.01 | HyClone |
Penicillin-Streptomycin | SV30010 | HyClone |
DPBS | 14287 | GIBCO, by Life Technologies |
Puromycin | P8833 | Sigma-Aldrich |