Summary
FRET-gebaseerde reporters steeds vaker gebruikt voor het kinase en fosfatase activiteiten in levende cellen te volgen. Hier beschrijven we een methode voor het FRET-gebaseerde verslaggevers gebruiken om celcyclus-afhankelijke veranderingen te beoordelen in doel fosforylering.
Abstract
Förster resonance energy transfer (FRET)-gebaseerde verslaggevers 1 laat de beoordeling van de endogene kinase en fosfatase activiteiten in levende cellen. Dergelijke sondes bestaan gewoonlijk uit van varianten van het GVB en YFP, ingegrepen door een fosforyleerbare volgorde en een fosfo-bindend domein. Bij fosforylering, de sonde verandert conformatie, hetgeen resulteert in een verandering van de afstand of oriëntatie tussen het GVB en YFP, wat leidt tot een verandering in de FRET efficiëntie (afb. 1). Verschillende sondes zijn gepubliceerd in het laatste decennium, het toezicht op de activiteit saldo van meerdere kinases en fosfatasen, waaronder verslaggevers van PKA 2, 3 PKB, PKC 4, PKD 5, 6 ERK, JNK 7, CDK 18, Aurora B 9 en Plk1 9 . Gezien de modulaire ontwerp, extra sondes waarschijnlijk ontstaan in de nabije toekomst 10.
Voortgang door de celcyclus wordt beïnvloed door stress signaling paden 11. Met name, is de celcyclus en gemeente verschillend geregeld tijdens onverstoord de groei in vergelijking met wanneer de cellen zich herstellen van stress 12. Time-lapse beeldvorming van cellen door de celcyclus dan ook bijzondere voorzichtigheid vereist. Dit wordt een probleem, vooral wanneer zij een beroep ratiometrische imaging, aangezien twee beelden met een hoge signaal-ruisverhouding nodig zijn om correct te interpreteren de resultaten. Ratiometrische FRET beeldvorming van celcyclus afhankelijke veranderingen in kinase en fosfatase activiteiten is voornamelijk beperkt tot sub-secties van de celcyclus 8,9,13,14.
Hier bespreken we een methode om FRET-gebaseerde probes met ratiometrische beeldvorming in de gehele menselijke cel-cyclus te volgen. De methode is gebaseerd op materiaal dat beschikbaar is voor veel onderzoekers in life sciences en vereist geen specialistische kennis van microscopie of beeldverwerking.
Protocol
1. Introductie van de sonde naar de cellen
- Co-transfecteren cellen met een FRET-gebaseerde probe en een plasmide resistentie. Kies een transfectie methode die efficiënt is in uw cel-type van belang. Voor U2OS cellen, standaard calciumfosfaat transfectie methoden geven voldoende resultaat 15.
- Selecteer cellen in de juiste antibioticum voor ten minste zeven dagen. Dit verrijkt de hoeveelheid cellen die de sonde en beperkt de hoeveelheid cellen met giftige expressie levels, of expressie niveaus, die sterk van invloed op de celcyclus.
- (Optioneel) Selecteer voor stabiele klonen.
- Met behulp van vaste of levende cellen, controleert zowel de CFP en YFP zijn aanwezig in alle cellen op ongeveer dezelfde verhouding.
- In het geval dat sommige cellen bevatten slechts CFP of YFP, is recombinatie waarschijnlijk plaatsgevonden. Recombinatie kan optreden tijdens de groei van bacteriën of na transfectie van de sonde en kan in het laatste geval hangt af van plasmide kwaliteit. Herhalen plasmide preparatie en lineariseren het plasmide voor transfectie als het probleem aanhoudt.
2. Monitoring ratiometrische FRET
- Zaad cellen op met glazen bodem gerechten, of dekglaasjes voor montage in een kamer. Zorg ervoor dat de borden / dekglaasjes zijn geen 1.5 (170 micrometer dik).
- Mount cellen in groei medium zonder fenol rood op een gemotoriseerde epifluorescentiemicroscoop met temperatuurregeling ingesteld op 37 ° C. Zorg voor pH-regulering van media, hetzij door CO 2 of met behulp van CO 2-onafhankelijke media, zoals Liebowitz-15.
- Focus op cellen met behulp van doorvallend licht. Kijk niet op cellen met behulp van TL-licht.
- Begin met het verwerven van een 12 of 16 bits beeld met YFP excitatie (YFPex) en YFP emissie (YFPem) filters en een geschikte dichroïde spiegel. Gebruik maximaal binning beschikbaar die nog steeds toelaat de vereiste subcellulaire resolutie. Met behulp van een hoge binning de blootstelling tijd of intensiteit verlagen is cruciaal voor fototoxiciteit te voorkomen.
- Measure of schatten de achtergrond intensiteit en de benadering door het meten van geluid of het schatten van de ruwe gemiddelde, minimale en maximale pixel waarden in een gebied zonder cellen. Verandering belichtingstijd en grijsfilters, zodat het gemiddelde signaal in de cel is ongeveer de achtergrond intensiteit plus vijf tot tien keer het verschil tussen max en min achtergrond intensiteiten.
- Controleer of de afbeeldingen niet goed als verzadigd. De maximale lichtsterkte in de afbeelding moet worden minder dan de helft van het dynamisch bereik (bijv. max 2000 in een 12-bits afbeelding) om te zorgen voor de intensiteit verschillen wanneer de cellen in te voeren mitose.
- Herhaal stap 2,4 tot 2,6 met behulp van CFP excitatie-en emissie YFP filters en een geschikte dichroïde spiegel.
- Selecteer meerdere regio's met getransfecteerde cellen, met uitzondering van de regio's gebruikt worden voor punt 2.4 van 2.7, en ervoor zorgen dat maximale intensiteit is minder dan de helft van het dynamisch bereik in alle cellen.
- Start een time-lapse experiment de overname van twee beelden per 45 min met behulp van YFPex - YFPem en CFPex - YFPem filter sets.
3. Verifiëren en optimaliseren van voorwaarden
- Open de verworven beelden en toezicht op de celcyclus tijd van mitose tot mitose voor cellen die de getransfecteerde sonde uit te drukken.
- Vergelijk de gemeten celcyclus tijd om gepubliceerde gegevens voor de gebruikte celtype. Als alternatief, film ongetransfecteerde cellen door het verwerven van een beeld van doorvallend licht slechts (bijvoorbeeld DIC of fase-contrast) elk uur om te verwijzen cel cyclustijden te krijgen.
- In het geval dat de tijd van mitose naar mitose stemt overeen met referentie celcyclus timings, ga dan naar stap 4. Als alternatief, re-te verwerven beelden met behulp van harder blootstelling, meer tijd-punten of meerdere z-niveaus en herhaal stap 3.
- In het geval dat de tijd van mitose naar mitose niet overeenkomt met de celcyclus timings referentie-, film-getransfecteerde cellen door de overname van een beeld van doorvallend licht slechts (bijvoorbeeld DIC of fase-contrast) elk uur gevolgd door een image op het eindevan het experiment om getransfecteerde cellen te identificeren.
- Als de getransfecteerde cellen vertonen nog steeds langere celcyclus keer, herhaalt u stap 1, maar transfecteren minder sonde of te kiezen voor een stabiele klonen die zeer kleine hoeveelheden van de sonde bevatten.
- Als de getransfecteerde cellen vertonen een normale celcyclus keer in de afwezigheid van TL-licht, herhaalt u stap 2, maar lagere blootstelling door het wijzigen binning, grijsfilters, belichtingstijd, en de tijd tussen de afbeeldingen.
4. Analyseren van FRET
- De analyse kan worden uitgevoerd door de meeste software gewijd aan de microscopie. Hier beschrijven we hoe u de analyse met behulp van de freeware ImageJ (uit te voeren http://rsb.info.nih.gov/ij ) gebruik te maken van de plugin Ratio Plus ( http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus . html ).
- Open de afbeeldingen in ImageJ. In het geval dat uw foto's worden in de vorm van een multicolor STACk (bv. Deltavision), apart van de afzonderlijke kanalen door eerst te converteren naar een HyperStack: Image-HyperStack-stack te HyperStack en vervolgens te splitsen naar single channel stacks met: Image-HyperStack-dimensionaliteit te verminderen
- Vermenigvuldig de YFPex - YFPem stack met 3 met behulp van: Proces-Math-Vermenigvuldigen Deze stap is optioneel, want het is alleen bedoeld om het visuele helderheid van de beelden te verhogen door ervoor te zorgen dat niet ratio's worden in het bereik tussen 0 en 1.
- In de YFPex - YFPem stack, trekken een regio of interest (ROI) in een gebied dat verstoken is van cellen, maar dat is dicht bij een cel te meten. Verschillende cellen in dezelfde afbeelding kunnen verschillende regio's, zowel als achtergrond en intensiteit van het signaal meestal is het sterkst in het midden van een beeld.
- Voeg de ROI aan ROI manager: Analyseren-tools-ROI manager.
- Meet de gemiddelde intensiteit van de ROI in zowel de YFPex - YFPem en de CFPex - YFPem stack: Analyseer-Meet
- Herhaal dit op meerdere tijdstippen en controleer of achtergrond intensiteiten dicht bij de cel van belang zijn vergelijkbaar in de hele film.
- Stel metingen om een minimale intensiteit zijn onder meer: Analyze-Set-metingen-Min en Max grijs waarde.
- Teken een regio van belang die het grootste deel van een cel en meet de minimale intensiteit in zowel de YFPex - YFPem en de CFPex - YFPem stack. Neem het verschil tussen de gemeten minimale intensiteit en de achtergrond intensiteit van 4,6 en delen door twee. Dit biedt een uitgangspunt schatting voor een clipping waarde.
- Open Ratio Plus. Selecteer de YFPex - YFPem en de CFPex - YFPem stack. Voor de FRET-ratio, selecteer CFPex - YFPem als stack 1, voor de omgekeerde FRET-ratio visualiseren van sondes waar efficiëntie afneemt FRET op fosforylering, selecteer YFPex - YFPem als stack 1.
- Plaats de gemeten intensiteiten achtergrond en het knippen waarden.
- Stel de schaling van de daaruit voortvloeiende verhouding tussen stack en toepassen van een geschikte blik up table (LUT) naar verhouding veranderingen te visualiseren.
5. Representatieve resultaten
Plk1 activiteit voor het eerst zichtbaar in de kern in de G2-fase en pieken tijdens de mitose. Figuur 3 toont een experiment met minimale fototoxiciteit instellingen zoals beschreven in paragraaf 2. Let op: dit is een representatief eerste resultaat en dat de blootstelling voorwaarden of de tijd tussen de beelden kunnen worden aangepast om het signaal te verhogen tot ruis ratio of temporele resolutie. Figuur 3D toont aan dat een meerderheid van de cellen die de sonde vermenigvuldigen met een celcyclus tijd van tussen de 20 en 25 uur, wat aangeeft dat de beeldvorming voorwaarden en de expressie van de sonde niet celcyclus timings beïnvloeden. Hoewel er veel ruis, de trend van Plk1 activiteit toe in G2 en een piek in de mitose 14 is duidelijk zichtbaar (fig. 3A). De verwerking van de ruwe data, hier door betekenen filteren gepresenteerd als een kymograaf (fig. 3B), of kwantificering van de gemiddelde omgekeerde ra Tio (fig. 3C) kan verbeteren duidelijkheid.
Figuur 1. Principe van een FRET-gebaseerde sonde naar kinase en fosfatase te controleren. Twee fluoroforen, typisch CFP (blauw) en YFP (groen), zijn verbonden door een fosfo-bindend domein (oranje) en een fosforyleerbare sequence (geel). Fosforylering (rood) bemiddelt binding aan de fosfo-bindende domein, en veroorzaakt daardoor een conformationele verandering in de sonde. De conformationele verandering resulteert in een verschil in de afstand of oriëntatie tussen de twee fluoroforen, die invloed op de FRET efficiëntie tussen het GVB en YFP. FRET kan worden gevisualiseerd door spannende CFP en YFP controle emissie (stippellijnen).
Figuur 2. Schematisch overzicht van de experimentele procedure.
p_upload/3410/3410fig3.jpg "/>
Figuur 3. Plk1 activiteit voor het eerst zichtbaar in de kern in de G2-fase en pieken tijdens de mitose. U2OS cellen die een FRET-gebaseerde probe controle Plk1 activiteit 9,14 werden gefilmd voor 60 uur gebruik van een Deltavision Spectris imaging systeem uitgerust met een 20x NA 0,7 lucht-doelstelling en een kwiklamp. Imaging omstandigheden werden geselecteerd om minimaal fototoxiciteit veroorzaken, zoals uiteengezet in sectie 2, met behulp van 4x binning en neutrale dichtheid filters die blokkeren 99% van het binnenkomende licht. A, valse voorstelling van kleur omgekeerde FRET-ratio, het volgen van een cel tot en met 4 divisies. B, kymograaf van de cel getoond in A na het toepassen van een gemiddelde filter. C, kwantificering van de omgekeerde FRET-ratio van de cel getoond in A. D, cumulatieve mitotische ingang van 50 FRET-probe tot expressie brengende cellen, met inbegrip van divisies van dochtercellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Monitoring FRET gedurende de celcyclus vereist overwegingen die minder belangrijk bij de beoordeling van de korte termijn reacties op prikkels van buitenaf. Ten eerste is celcyclusprogressie gemakkelijk verstoord door stress signaleren, te verlangen dat fototoxiciteit is tot een minimum beperkt. Ten tweede, kunnen alle reporters potentieel van invloed op cellulaire processen door titratie van kinasen, fosfatasen of interactie domeinen. De waarschijnlijk meest eenvoudige manier om te beoordelen of de experimentele omstandigheden voldoende zijn om de cel cyclus lengte meten van mitose naar mitose en te vergelijken met experimenten onafhankelijk van fluorescentie beeldvorming en expressie van een probe.
Een cruciale factor bij het toezicht op FRET verhoudingen gedurende de celcyclus is bestand zijn tegen de verleiding om prachtige beelden te verkrijgen met een hoge resolutie. Hoewel de precieze instellingen zijn afhankelijk van de gevoeligheid van de microscoop systeem en expressie niveau en de aard van de specifieke probe, is het belangrijk te gebruikeneen niveau van binning dat overeenkomt met wat absoluut noodzakelijk is om te zien. Hoewel de tijd tussen CFPex - YFPem en YFPex - YFPem beelden moeten worden kort om veranderingen in de cel morfologie, in onze handen te voorkomen is het beter om de blootstelling keer te houden op meer dan 0,1 seconden en de intensiteit van het TL-licht te verminderen door grijsfilters .
Hoe fototoxiciteit van invloed op de celcyclus hangt grotendeels af van expressie en lokalisatie van de sonde. Een sonde die is gelokaliseerd op chromatine, bijvoorbeeld door fusie met een histon, maakt cellen gevoeliger voor TL-licht, vermoedelijk omdat fototoxisch bijproducten worden gemaakt in de omgeving van DNA. Het is daarom van cruciaal belang om cellen die relatief lage niveaus van de verslaggevers Express controleren en opnieuw te checken cel-cyclus timings als het lokaliseren van de sonde naar verschillende subcellulaire structuren.
Verschillende controle-experimenten zijn nodig om te verifiëren dat FRET aanwezig is in deexperimentele opstelling en dat de verhouding tussen veranderingen weerspiegelen de werkelijke fosforylering van een probe. Behalve de functionele controles, zoals remming of uitputting van een kinase, is het raadzaam om te presteren biochemische experimenten om te controleren of de sonde is gefosforyleerd, mutatie van de verwachte fosfo-acceptor site binnen de sonde naar een niet-fosforyleerbare residu, en acceptor photobleaching, om bewijzen dat het optreden van FRET. Voor een voorbeeld van een uitgebreide validatie, zie aanvullende figuur 3 in ref 14.
Hoewel het theoretisch beter te beoordelen veranderingen FRET door het bewaken van zowel de CFP en YFP-emissie, zoals setups zijn zeer gevoelig voor veranderingen en verlichting voorwaarden focus en kan gemakkelijk leiden tot artefacten. Gevoeligheid voor veranderingen focus is te wijten aan chromatische aberratie, waar CFP en YFP-uitstoot richten zich niet op hetzelfde punt. Verlichting veranderingen zijn grotendeels afhankelijk van de verschillende uitlijning van het lichtpad. Dit is vooral prominent bij het gebruik van filter kubussen met daarineen dichroïde spiegel. Focus en belichting verandering kan worden verminderd met behulp van gecorrigeerd doelstellingen en zorgvuldig uitgelijnd filter blokjes. Echter, in onze ervaring, waardoor de uitstoot filter constante geeft superieure resultaten, bij voorkeur met behulp van een setup met aparte controle van de excitatie en emissie filters.
De omvang van de waargenomen FRET-verandering wordt verminderd door bleedthrough van het GVB naar de fluorescentie emissie YFP filter. In het geval dat bleedthrough is aanzienlijk, een extra CFPex - CFPem beeld kan worden verkregen tot bleedthrough te corrigeren in de CFPex - YFPem beeld. Echter, dergelijke correcties zijn zeer gevoelig voor verschillen in focus en mogen invoeren artefacten. Daarnaast, ze vereisen een extra beeld, dat kan leiden tot fototoxiciteit.
Hoewel het minder een probleem wanneer alleen de controle YFP-emissie, het houden van de cellen in focus gedurende een 24 + time-lapse experiment kan een uitdaging zijn. Om te voorkomen dat zich drijft, zorg ervoor dat de microscoopen de schotel is voorverwarmd en dat de temperatuur in de ruimte niet schommelen. U kunt ook een autofocus systeem dat niet gebaseerd is op beeldvorming van de getransfecteerde sonde.
De keuze van de doelstelling om te gebruiken hangt af van de specifieke toepassing. Een olie op basis van hoge NA objectieve verzamelt meer licht en geeft hogere resolutie, maar is meer gevoelig voor focus verandert en is onpraktisch in high-content setups. Wij geven de voorkeur aan een lucht objectief te gebruiken met een relatief hoge NA cytoplasmatische of nucleaire FRET-ratio's studie, en gebruik een hoge NA olie doelstellingen alleen wanneer hogere subcellulaire resolutie is vereist.
Deze paper bespreekt een eenvoudige methode om de film FRET-gebaseerde probes door de cel cyclus die apparatuur die algemeen beschikbaar zijn voor vele life science onderzoekers en vereisen slechts een basale kennis van microscopie en beeldverwerking gebruikt. Meer gespecialiseerde alternatieven behoren het gebruik van de balk-splitters, Fluorescence Lifetime Microscopy (FLIM) 1 en software om bezwaar segmentatie 16 en berekening van de te automatiseren FRET-ratio 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs worden ondersteund door de Zweedse onderzoeksraad, de Zweedse stichting voor strategisch onderzoek, de Zweedse Cancer Society, de Zweedse kind Cancer Society, Åke Wibergs fundering en Jeanssons stichting.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz L-15, no phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 21083-027 | |
| DMEM+Glutamax-I | GIBCO, by Life Technologies | 31966 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SV30160.03 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Hyclone | SH30236.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14287 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 |
References
- Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).
- Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter. J. Biol. Chem. 280, (2005).
- Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).
- Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter. Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).
- Harvey, C. D. A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).
- Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).
- Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis. Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).
- Fuller, B. G. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453, 1132-1136 (2008).
- Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters. Methods. 40, 279-286 Forthcoming.
- Morgan, D. O. The cell cycle : principles of control. , New Science Press, in association with Oxford University Press. (2007).
- Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network. J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).
- Macurek, L. Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery. Nature. 455, 119-123 (2008).
- van der Eb, A. J., Graham, F. L. Assay of transforming activity of tumor virus DNA. Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).
- Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. Biotechniques. 42, 71-75 (2007).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution. Cytometry A. 75, 761-767 (2009).
