Este protocolo muestra los métodos utilizados para establecer entornos 2D y 3D en las cámaras de electrotactic de diseño personalizado, que puede rastrear las células In vivo / ex vivo Con lapso de tiempo de grabación en el nivel de células individuales, a fin de investigar galvanotaxia o electrotaxis y otras respuestas celulares a la corriente directa (DC) los campos eléctricos (EFS).
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Artículo de método
Campo eléctrico controlado por migración dirigida de células progenitoras neurales en entornos 2D y 3D
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Endógenos campos eléctricos (EFS) de forma natural en vivo y desempeñan un papel fundamental durante el desarrollo del tejido / órgano y la regeneración, incluida la de los 1,2 del sistema nervioso central. Estos FAN endógenos son generados por la regulación celular de transporte iónico en combinación con la resistencia eléctrica de las células y tejidos. Se ha informado de que aplicada EF tratamiento puede promover la reparación funcional de lesiones de la médula espinal en animales y humanos 3,4. En particular, EF-dirigida migración celular se ha demostrado en una amplia variedad de tipos celulares 5,6, incluyendo las células progenitoras neurales (NPC) 7,8. Aplicación de corriente continua (DC) FAN no es una técnica disponible en la mayoría de los laboratorios. Hemos descrito los protocolos de aplicación de los FAN DC a cultivos de células y tejidos previamente 5,11. Aquí presentamos un video de demostración de los métodos estándar basado en una intensidad de campo calculada para crear un 2Dd entornos 3D para los NPCs, y para investigar las respuestas celulares a la estimulación de EF en ambas condiciones de crecimiento de células individuales en 2D, y la porción de la médula espinal organotípico en 3D. El cordslice espinal es un tejido receptor ideal para el estudio del NPC comportamientos ex vivo, post-trasplante, debido a que la organización del tejido citoarquitectura está bien conservada dentro de estas culturas 9,10. Además, este modelo ex vivo también permite que los procedimientos que no sean técnicamente viables para rastrear las células in vivo utilizando lapso de tiempo de grabación en el nivel de células individuales. Es sumamente esencial para evaluar el comportamiento celular no sólo en un entorno 2D, sino también en una condición 3D organotípico que imita el entorno in vivo. Este sistema permitirá a imágenes de alta resolución con cubierta a base de platos de cristal en el tejido o el cultivo de órganos con seguimiento 3D de la migración celular solo in vitro y ex vivo y puede ser un paso intermedio antes de pasar a en vivo paradigmas.
Protocolo
1. Progenitoras neurales de aislamiento de células
- Diseccionar los cerebros enteros de E14-16 ratones y el lugar en frío DMEM/F12 medio basal. Quite todas las meninges con un microscopio anatómica y la transferencia de cerebros en un plato de Petri de 35 mm.
- Use unas pinzas finas para disociar mecánicamente cerebros en fragmentos de tejido y los transfiere a un tubo de 15 ml, centrifugar las muestras a 800 rpm durante 3 minutos para eliminar los residuos.
- Añadir DMEM/F12 que contiene bFGF y EGF y se tritura con una pipeta de 1 ml.
- Pasar la suspensión celular a través de un filtro de células para obtener una suspensión de célul....
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Discusión
Los protocolos que utilizamos se basa en estudios previos 5,11. El uso de estos métodos, la cultura estable y eléctrica actuales condiciones se puede mantener mientras se aplica una EF a través de puentes de agar, la solución de Steinberg, y los electrodos de Ag / AgCl, a las células o rodajas cultivadas en cámaras electrotactic diseño personalizado de dimensiones normalizadas y precisa. La profundidad de las cámaras puede ser ajustada para adaptarse a diferentes espesores de la muestra 11, y en el.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Real Sociedad URF subvención UF051616, Reino Unido y el Consejo Europeo de Investigación StG subvención 243.261 BS. El trabajo en el laboratorio de MZ también es apoyado por un Instituto de California de Medicina Regenerativa de subvención RB1-01417.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| FGF-básico humano recombinante | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng / ml |
| EGF humano recombinante | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng / ml |
| N2-Suplemento (100X) de líquido | Invitrogen | 02048 | |
| Medio DMEM/F12 (glucosa alta) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poli-D-lisina | Millipore | Una-003-E | |
| Natural de laminina de ratón | Invitrogen | 23017-015 | |
| Factor de reducción del crecimiento de la membrana basal de matriz (Matrigel) | BD Biosciences | 354230 | |
| Tampón HEPES | Gibco | 15630 | |
| McIlwain helicóptero del tejido | El Mickle Laboratorio de Ingeniería Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning de alto vacío grasa de silicona | Sigma-Aldrich | Z273554 |
Referencias
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
- B....
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Reimpresiones y permisos
