Summary
Ce protocole illustre des méthodes utilisées pour établir des environnements 2D et 3D dans les chambres electrotactic conçus sur mesure, qui permettent de suivre les cellules
Abstract
Endogènes des champs électriques (FE) sont naturellement présents in vivo et jouent un rôle crucial lors de tissus / organes de développement et de la régénération, y compris celle de la 1,2 du système nerveux central. Ces FE endogènes sont générées par la régulation cellulaire de transport ionique combinés à la résistance électrique de cellules et de tissus. Il a été rapporté que le traitement appliqué EF peut favoriser la réparation fonctionnelle des lésions de la moelle épinière chez les animaux et les humains 3,4. En particulier, la migration des cellules EF-dirigée a été démontrée dans une grande variété de types cellulaires 5,6, y compris les cellules progénitrices neurales (PNJ) 7,8. Demande de courant continu (DC) FE n'est pas une technique couramment disponible dans la plupart des laboratoires. Nous avons décrit des protocoles détaillés pour l'application de la FE DC à cultures cellulaires et tissulaires préalablement 5,11. Nous présentons ici une vidéo de démonstration de méthodes standards basées sur une intensité de champ calculée à mettre en place une 2Dd environnements 3D pour les PNJ, et d'enquêter sur les réponses cellulaires à la stimulation EF dans les deux conditions de croissance des cellules simples en 2D, et la tranche cordon organotypique épinière en 3D. Le cordslice épinière est un tissu receveur idéal pour étudier les comportements des PNJ ex vivo, post-transplantation, parce que l'organisation des tissus cytoarchitectoniques est bien conservé au sein de ces cultures 9,10. En outre, ce modèle ex vivo permet également des procédures qui ne sont pas techniquement possible de suivre des cellules in vivo en utilisant time-lapse d'enregistrement au niveau cellule unique. Il est essentiel d'évaluer de façon critique les comportements cellulaires, non seulement dans un environnement 2D, mais aussi dans un état 3D organotypique qui imite l'environnement in vivo. Ce système permettra l'imagerie haute résolution en utilisant la couverture à base de verre plats dans les tissus ou organes de la culture avec un suivi en 3D de la migration cellulaire unique in vitro et ex vivo et peut constituer une étape intermédiaire avant de passer à en viparadigmes VO.
Protocol
1. Neural isolement de cellules souches
- Disséquer cerveaux entiers de E14-16 chez la souris et les placer dans le froid du milieu DMEM/F12 basale. Retirez toutes les méninges sous un microscope anatomique et les cerveaux de transfert dans un plat de 35 mm de Petri.
- Utilisez une pince fine à dissocier mécaniquement cerveaux en fragments de tissus et de les transférer à un tube de 15 ml, puis centrifuger les échantillons à 800 tours par minute pendant 3 min pour éliminer les débris.
- Ajouter DMEM/F12 contenant bFGF et EGF et triturer avec une pipette de 1 ml.
- Passer la suspension de cellules à travers un tamis de cellules pour obtenir une suspension cellulaire unique.
- Cellules de la plaque dans des flacons à 2-5 x 10 4 cellules / ml, puis effectuer un plein milieu changer tous les 3 jours et le passage des cellules tous les 6 jours.
- Après au moins 5 passages, digest neurosphères à des cellules individuelles à l'aide de la trypsine et l'EDTA et de croître sur les chambres electrotactic poly-D-lysine/laminin-coated (préparé comme décrit ci-dessous en 2). Utilisez le milieu de culture contenant N2-supplément,bFGF et EGF à tout moment pour maintenir les propriétés de PNJ.
2. Préparation de la chambre de electrotactic
- Préparer 22 x 11 mm bandes de verre en divisant autoclave 22 x 22 mm d'épaisseur des lamelles no.1 dans la moitié à l'aide d'un stylo en diamant.
- Créer un verre autoportant et de dimensions intérieures 22 x 10 mm en recollant quatre verticalement debout 22 x 11 mm bandes avec de la graisse silicone de haute-vide. Autoriser les puits complètement sécher et durcir pendant la nuit.
- Le lendemain, attacher deux 22 x 11 mm bandes de verre, parallèlement les uns aux autres en laissant un écart de 10 mm, à la base d'une boîte de culture de 100 mm à l'aide de la graisse silicone. Sceller la région entre ces bandes en plaçant un 22 x 22 mm lamelle à chaque extrémité, fixé au fond du récipient avec de la graisse sur trois côtés, mais pas celle la plus proche du centre.
- Placez le verre bien préparé à l'étape 2.2 sur le couvercle glisse de sorte que les murs intérieurs de créer un espace confiné pour l'ensemencementles cellules sur le fond de la plaque. Imperméables à l'eau tous les joints avec de la graisse de silicone. Manteau cette région confinée de manière séquentielle avec la poly-D-lysine, puis la laminine: ajouter 1 ml de poly-D-lysine dans la chambre et sortir pendant 5 min à permettre l'acide poly-D-lysine pour se lier à la partie inférieure de la plaque; laver la chambre avec du PBS stérile à deux reprises, puis diluer la laminine dans du PBS stérile pour obtenir 20 pg / ml et utiliser pour couvrir le fond de la plaque. Laisser à température ambiante pendant la nuit.
- Le lendemain, les cellules de récolte et de préparation de 1 ml de suspension contenant 1 x 104 cellules. Retirez la laminine de la vitre du bien, lui permettant de sécher complètement, et les remplacer par 1 ml de suspension cellulaire. Placer le plat dans l'incubateur à 37 ° C pendant un minimum de 4 heures pour permettre la fixation.
- Une fois que les cellules sont suffisamment confluente retirer tout le milieu de la chambre. Retirez délicatement le verre bien. Former un toit au-dessus des cellules en prenant soin de fixation, avec de la graisse de silicone, un autoclave 22 x 22 mm une lamelle en verrepontage entre les deux 22 x 11 mm bandes. Couvrir les cellules avec quelques gouttes de milieu pour éviter le dessèchement.
- Former un réservoir moyen isolé à chaque extrémité de la chambre en créant deux barrières étanches graisse de silicone qui s'exécutent d'un bord de la coupelle à l'autre, sur le toit chambre. Remplir la chambre avec un milieu frais, assurant un flux-travers d'un réservoir de médium à l'autre. Retour le plat dans l'incubateur pendant 12 heures pour permettre la récupération des cellules.
3. L'application d'un champ électrique à la chambre de electrotactic
- Préparer un couvercle pour couvrir le plat en perçant deux trous, l'un placé au-dessus de chaque réservoir de la chambre de la migration.
- Remplacer tout le milieu dans la chambre du milieu de culture contenant 25 mM de tampon HEPES et transférer la capsule dans le système d'imagerie à température contrôlée. Mettre en place les paramètres expérimentaux pour la time-lapse et multi-position d'enregistrement. Aligner le chambre de sorte que la cathode et l'anode sontà gauche et à droite respectivement, pour que le vecteur EF s'étend horizontalement comme vu par le microscope et enregistrée dans le système d'imagerie.
- Remplir deux béchers avec une solution de Steinberg (58 mM de NaCl, 0,67 mM de KCl, 0,44 mM de Ca (NO 3) 2 .4 H 2 0, 1,3 mM MgSO 4 .7 H 2 0 et 4,6 mM Trizma de base, pH 7,4). Connecter un bécher séparée à chaque réservoir de médium à l'aide de ponts de verre préparées à l'avance des tubes de verre (environ 13 cm de long et environ 3 mm de diamètre, et pliée en forme de U par chauffage dans une flamme Bunsen), remplis de 2% (p / v) Steinberg's-agar solution, en passant par les trous dans le couvercle. Remplissez le circuit électrique en plaçant Ag / AgCl électrodes reliées à une alimentation CC dans chaque bécher de solution de Steinberg.
- Réglez la molette de tension sur l'alimentation à 0 et allumez-le. Mesurer la tension aux bornes de la chambre electrotactic tout en tournant le cadran de tension, à l'aide d'un voltmètre, et ajuster en fonction des besoins expérimentaux.
- Début d'enregistrement time-lapse. Effectuer une variation moyenne et réajuster la tension, selon les besoins, toutes les heures. Un milieu frais, les médicaments, les agents chimiques peuvent être ajoutées aux réservoirs, au besoin. Lorsque effectuer changement de milieu, deux options peuvent être considérées comme ci-dessous:
- Option n ° 1 - Pour mettre en pause l'enregistrement time-lapse temporairement, retirer soigneusement les ponts en verre de la chambre à éviter de perturber Couvercle, utiliser un stérilisés pipette Pasteur doucement remplacer tout le milieu par du milieu frais et de mettre les ponts de verre arrière, puis reprendre l'enregistrement.
- Option n ° 2 - Par ailleurs, fait sur mesure Couvercle avec 4 trous (deux positionné au-dessus de chaque réservoir de la chambre de la migration) peut également être utilisé à des fins de changement de milieu. Deux ponts pour le verre de connexion, les deux autres pour changer à moyen terme. Option 2 permet l'enregistrement en continu, sans ingérence lors du changement de support.
4. Préparation de la tranche la moelle épinière organotypique
- Disséquer lumbcordons ar la colonne vertébrale de 2 semaines vieille BL C57 / 6 souris.
- Trancher la moelle épinière en sections um d'épaisseur 500 avec un hachoir de tissus McIlwain.
- Tranches distinctes sous un microscope anatomique et sélectionner des tranches avec intacte sagittale / axiale structure de la moelle épinière.
- Plate tranches dans un plat de 35 mm de Pétri contenant 30 ul Matrigel et les placer aussi près que possible du centre et de les maintenir dans un 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C pendant au moins 30 min jusqu'à ce que le Matrigel protéines s'auto-assemblent pour produire un film mince qui recouvre la surface de la tranche la moelle épinière. Il est très important de s'assurer que Matrigel a été entièrement assemblé, incuber la boîte de Pétri à 37 ° C pendant 30 min si nécessaire.
- Ajouter 4-6 ml DMEM/F-12 milieu contenant 25 mM de tampon HEPES et 15-20% de sérum de veau foetal doucement de manière à éviter un écoulement moyen directement sur la tranche. Veiller à ce que la tranche n'est pas entièrement submergée dans le milieu, laissant la surface des explants bien exposée aul'air. Changer le milieu de deux fois par semaine.
5. L'injection de Hoechst 33342 PNJ marquées dans la tranche la moelle épinière organotypique
- Préparer la suspension NPC à 1 × 10 6 cellules / ul.
- Pré-incuber la suspension de cellules dans un milieu avec 5 uM Hoechst 33342 pour 30 min.
- Utilisez tube capillaire en verre de micro-injection 2 pi de suspension dans la tranche la moelle épinière lentement sous un microscope. Assurez-vous que le tube capillaire en verre passe à travers le Matrigel (partie rose sous le microscope) et d'atteindre à l'intérieur de la tranche la moelle épinière (tissu gris sous le microscope), restent à l'intérieur de la tranche la moelle épinière pendant au moins 30 secondes pour éviter la suspension de cellules de fonctionner plus. Mettez la boîte de Pétri contenant tranche la moelle épinière en incubateur (37 ° C 5% CO 2) et laissez-le pendant la nuit.
- Le lendemain, appliquer une EF de 500 mV / mm à la tranche la moelle épinière contenant Hoechst 33342-labellisés PNJ dans la chambre electrotactic (en utilisant les méthodes décrites dans3).
6. Les résultats représentatifs
Quand les PNJ ont été exposés à une gamme de FE physiologiques qu'ils ont montré la migration des cellules fortement dirigée vers la cathode (Figure 1). La même observation a également été faite au niveau de la cellule unique sur le modèle organotypique tranche la moelle épinière ex vivo, une imitation environnement 3D dans des conditions in vivo (figure 2).
Figure 1. PNJ montrent la migration dirigée dans FE. PC a montré la migration hautement orienté vers la cathode lors de l'exposition pour les CE, les lignes rouges et les flèches bleues représentent les trajectoires et la direction de mouvement de la cellule (A). B montre les voies de migration des PNJ. Bar: 50 pm.
Figure 2. PNJ transplantés afficher migration dirigée vers la cathode dans la tranche la moelle épinière organotypique
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Discussion
Les protocoles que nous utilisons sont basés sur des études antérieures 5,11. L'utilisation de ces méthodes, la culture stable et électrique conditions actuelles peut être maintenue tout en appliquant un EF par des ponts d'agar, la solution de Steinberg, et Ag / AgCl électrodes, à des cellules cultivées ou en tranches dans des chambres electrotactic conçus sur mesure de dimensions normalisées et précis. La profondeur de chambres peut être ajusté pour tenir compte d'échantillon différentes épaisseurs 11, et dans le cas de cellules, taille de la chambre peut être modifié pour tenir compte toutefois de nombreuses cellules sont nécessaires (par exemple analyse par Western blot nécessite de nombreuses cellules). Nous avons modifié et développé ces méthodes pour permettre aux procédures qui ne sont pas techniquement possible de suivre des cellules in vivo en utilisant time-lapse enregistrement à un niveau cellulaire unique. La majorité de la recherche précédente sur les réponses cellulaires à EFS, a été menée dans des environnements 2D. L'étude in vivo de la réponse electrotactic de PNJ à un niveau cellulaire uniquefournirait des preuves à l'appui de pivot toute pertinence physiologique. Cependant, cela est techniquement très difficile à réaliser avec la technologie actuelle, surtout lorsqu'on tente d'obtenir en temps réel des enregistrements de migration cellulaire. Nous avons pris de nouvelles mesures pour établir un ex vivo organotypique épinière modèle de culture cordon tranche, en étroite collaboration imitant l'environnement in vivo, démontrant que les cellules possèdent encore une réponse electrotactic dans un environnement 3D, comme le montre la figure 2. Cette méthode pourrait également être adapté pour observer les effets de la FE sur une grande variété de types de cellules dans un environnement 3D organotypique, tels que la cicatrisation des plaies dans les tissus épithéliaux, angiogénèse dans l'anneau aortique ou un oisillon CAM, et les effets éventuellement génétiques dans l'embryon de poulet .
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la subvention de la Société royale URF UF051616, Royaume-Uni et l'European Research Council StG subvention à la norme BS 243261. Le travail en laboratoire est MZ également soutenue par une California Institute of Regenerative Medicine subvention RB1-01417.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-basic Recombinant Human | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng/mL |
| EGF Recombinant Human | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng/mL |
| N2-Supplement (100X) liquid | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 medium (high glucose) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poly-D-Lysine | EMD Millipore | A-003-E | |
| Natural mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Growth factor reduced Basement Membrane Matrix (Matrigel) | BD Biosciences | 354230 | |
| HEPES buffer | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
References
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