Summary
Dit protocol laat zien methoden die worden gebruikt om 2D-en 3D-omgevingen tot stand in de speciaal ontworpen electrotactic kabinet, kan volgen cellen
Abstract
Endogene elektrische velden (EFS) komen van nature voor in vivo en spelen een cruciale rol tijdens het weefsel / orgaan ontwikkeling en regeneratie, waaronder die van het centrale zenuwstelsel 1,2. Deze endogene EF worden gegenereerd door cellulaire regulatie van ionentransport combinatie met de electrische weerstand van cellen en weefsel. Er werd gemeld dat de toegepaste EF behandeling kan functioneel herstel van ruggenmergletsels bij dieren en mensen 3,4 bevorderen. In het bijzonder heeft EF gerichte celmigratie aangetoond in een grote verscheidenheid aan celtypen 5,6, zoals neurale progenitorcellen (NPC) 7,8. De toepassing van gelijkstroom (DC) EF is niet een algemeen beschikbare techniek in de meeste laboratoria. We hebben beschreven gedetailleerde protocollen voor de toepassing van DC EF naar cel-en weefselculturen eerder 5,11. Hier presenteren we een video-demonstratie van standaard methoden op basis van een berekende veldsterkte op te zetten 2D eend 3D-omgevingen voor de NPC's, en cellulaire reacties onderzoeken EF stimulatie, zowel in single cell groeiomstandigheden in 2D, en de organotypische ruggenmerg slice in 3D. De spinale cordslice is een ideale ontvanger weefsel voor het bestuderen van NPC ex vivo gedrag, post-transplantatie, omdat de cytoarchitectonic weefsel organisatie is goed bewaard gebleven binnen deze culturen 9,10. Daarnaast biedt deze ex vivo model maakt het ook mogelijk procedures die niet technisch mogelijk is om cellen te volgen in vivo met behulp van time-lapse opname op de enkele cel niveau. Het is kritisch essentieel cel gedrag evalueren niet alleen een 2D milieu, maar ook in 3D organotypische aandoening die nabootst de in vivo omgeving. Dit systeem zal in hoge resolutie imaging met dekking van glas-gerechten op basis van in weefsel of orgaan cultuur met 3D-tracking van de cel migratie in vitro en ex vivo en kan een tussenstap alvorens op in vivo paradigma's.
Protocol
1. Neurale voorlopercellen celisolatie
- Ontleden hele hersenen van E14-16 muizen en plaats in de koude DMEM/F12 basale medium. Verwijder alle hersenvliezen op grond van een anatomische microscoop en de overdracht hersenen in een 35 mm petrischaal.
- Gebruik fijne tang om mechanisch hersenen distantiëren in het weefsel fragmenten en overbrengen naar een 15 ml buis en centrifugeer monsters bij 800 rpm gedurende 3 minuten om vuil te verwijderen.
- Voeg DMEM/F12 met bFGF en EGF en fijnstampen met een 1 ml pipet.
- Laat de celsuspensie met een cel zeef een enkele celsuspensie te verkrijgen.
- Plaat cellen in kolven bij 2-5 x 10 4 cellen / ml, dan is een volledige medium te veranderen om de 3 dagen en passage van de cellen om de 6 dagen.
- Na tenminste 5 passages digest neurospheres om afzonderlijke cellen met trypsine en EDTA en groeien op poly-D-lysine/laminin-coated electrotactic kamers (bereid zoals hieronder beschreven in 2). Gebruik de groeiende medium met N2-supplement,bFGF en EGF te allen tijde eigendom van NPC's te behouden.
2. Voorbereiding van de electrotactic kamer
- Bereid 22 x 11 mm stroken van glas door te delen geautoclaveerd 22 x 22 mm dikte no.1 dekglaasjes in de helft van het gebruik van een diamant pen.
- Maak een vrijstaande glazen en van het interieur afmetingen 22 x 10 mm door het verlijmen van vier verticaal staan 22 x 11 mm stroken met high-vacuüm siliconenvet. Laat de putten volledig drogen en uitharden 's nachts.
- De volgende dag hechten twee 22 x 11 mm glasstrips, evenwijdig aan elkaar met een afstand van 10 mm, met de basis van een 100 mm kweekschaal met siliconenvet. Afdichten het gebied tussen deze strippen door een 22 x 22 mm dekglas aan elk uiteinde aan de bodem van de schaal met vet aan drie zijden, maar dat het dichtst bij het centrum.
- Plaats het glas goed voorbereid in stap 2.2 op de dekglaasjes, zodat de binnenmuren een afgesloten ruimte te creëren voor het zaaiende cellen op de bodem van de plaat. Water-proof alle verbindingen met siliconenvet. Coat deze kleiner gebied opeenvolgend met poly-D-lysine dan laminine: 1 ml poly-D-lysine in de kamer en laat gedurende 5 minuten om de poly-D-lysine te binden aan de onderzijde van de plaat, wassen kamer met steriele PBS tweemaal verdun laminine in steriele PBS 20 mg / ml te verkrijgen en de bodem van de plaat bedekken. Laat op kamertemperatuur gedurende de nacht.
- De volgende dag, de oogst cellen en voor te bereiden 1 ml suspensie met 1 x 104 cellen. Verwijder laminine het glas goed, zodat het volledig lucht drogen en met 1 ml celsuspensie vervangen. Zet de schaal in de incubator bij 37 ° C gedurende ten minste 4 uur om voor bevestiging.
- Zodra de cellen voldoende confluent verwijder medium uit de kamer. Voorzichtig en verwijder het glas. Vorm een dak boven de cellen door zorgvuldig bevestigen, met siliconenvet, een autoclaaf 22 x 22 mm glas dekglaasjeoverbruggen tussen de 22 x 11 mm strips. Bedek de cellen met een paar druppels medium om uitdroging te voorkomen.
- Vorm een op zichzelf staand medium reservoir aan elk uiteinde van de kamer door het creëren van twee waterdichte siliconenvet barrières die worden uitgevoerd van de ene rand van de schotel naar de andere, over de kamer dak. Vul de kamer met vers medium, waardoor een doorstroom van het ene medium reservoir naar de andere. Zet de schotel naar de incubator gedurende 12 uur mogelijk te maken cel herstel.
3. Toepassing van een elektrisch veld aan de kamer electrotactic
- Bereid een deksel op de schotel te dekken door het boren van twee gaten, een zich over elk reservoir van de migratie kamer.
- Vervang alle medium in de kamer met kweekmedium dat 25 mM HEPES buffer en breng de schotel naar de temperatuur-gecontroleerde imaging systeem. Stel de experimentele parameters voor time-lapse en multi-positie opname. Lijn de kamer zodat de kathode en anode zijnlinks en rechts, zodat de EF vector horizontaal loopt zoals gezien beneden de microscoop en in het afbeeldingssysteem.
- Vul twee bekers met de oplossing Steinberg (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca (NO3) 2 0,4 H 2 0, 1,3 mM MgSÛ4 0,7 H 2 0 en 4,6 mM Trizma base, pH 7,4). Sluit een andere beker elk medium reservoir met bereide glas bruggen (glazen buisjes ~ 13 cm lang en ~ 3 mm in diameter, en gebogen in een U-vorm door verhitting in een bunsenvlam), gevuld met 2% (w / v) Steinberg's-agar oplossing, die door de gaten in het deksel. Vul het elektrische circuit door het plaatsen van Ag / AgCl elektroden aangesloten op een DC-voeding in elk bekerglas van Steinberg's oplossing.
- Stel de spanning knop op de voeding op 0 en in te schakelen. Meet de spanning over de electrotactic kamer draaien, de spanning wijzerplaat met een voltmeter en pas de experimentele eisen.
- Start time-lapse opname. Voer een medium verandering en stel de spanning, zoals vereist, elk uur. Vers medium, drugs of chemische middelen worden toegevoegd om de reservoirs zoals vereist. Bij het uitvoeren van medium veranderen, kunnen twee opties worden beschouwd als hieronder:
- Optie No.1 - Om te pauzeren van de time-lapse-opname tijdelijk, zorgvuldig glazen bruggen te verwijderen uit de kamer om te voorkomen dat verstoren deksel, een gesteriliseerde Pasteur pipet voorzichtig gebruik maken van de plaats van alle medium met vers medium en zet de glazen bruggen terug, hervat dan de opname.
- Option No.2 - Als alternatief maat deksel met 4 gaten (twee boven elkaar bevindende reservoir van de migratie kamer) kunnen ook worden gebruikt voor medium verandering doel. Twee voor glas bruggen verbinding, de andere twee voor het veranderen medium. Optie 2 kan continu opnemen zonder inmenging tijdens het medium veranderen.
4. Voorbereiding van de organotypische ruggenmerg slice
- Ontleden LumbAR ruggenmerg van 2 weken oude C57 BL / 6 muizen.
- Snijd het ruggenmerg in 500 urn dikke secties met een McIlwain weefsel chopper.
- Aparte plakken onder een anatomische microscoop en selecteer plakken met intacte sagittale / axiale ruggenmerg structuur.
- Plaat plakken in een 35 mm Petri schaal die 30 pl Matrigel en plaatst deze in de buurt van het centrum mogelijk te houden in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten tot Matrigel eiwitten zichzelf assembleren produceren een dunne laag die het oppervlak van het ruggenmerg segment omvat. Het is belangrijk ervoor te zorgen dat Matrigel is samengesteld volledig de petrischaal incuberen bij 37 ° C gedurende 30 min indien nodig.
- Voeg 4-6 ml DMEM/F-12 medium dat 25 mM HEPES buffer en 15-20% foetaal kalfsserum zachtjes om mediumstroom rechtstreeks te op het schijfje. Zorg ervoor dat het schijfje niet helemaal ondergedompeld in medium, waardoor het oppervlak van explantaten goed blootgesteld aande lucht. Wijzig medium tweemaal per week.
5. Injectie van Hoechst 33342 label NPC's in de organotypische ruggenmerg slice
- Bereid de NPC schorsing op 1 × 10 6 cellen / ul.
- Pre-incubeer de celsuspensie in medium met 5 pM Hoechst 33342 gedurende 30 minuten.
- Gebruik capillaire glazen buis tot en met 2 pl suspensie langzaam microinject in het ruggenmerg slice onder een microscoop. Zorg ervoor dat capillaire glazen buis gaat door de Matrigel (roze gedeelte onder de microscoop) en te bereiken aan de binnenkant van het ruggenmerg slice (grijs weefsel onder de microscoop), blijven in het ruggenmerg slice gedurende minstens 30 seconden om celsuspensie overreden te voorkomen. Zet de petrischaaltje met het ruggenmerg slice in incubator (37 ° C 5% CO 2) en laat een nacht staan.
- De volgende dag, pas een EF van 500 mV / mm aan het ruggenmerg slice met Hoechst 33342-gelabelde NPC's in de electrotactic kamer (met behulp van de methoden beschreven in3).
6. Representatieve resultaten
Bij NPC's werden blootgesteld aan een reeks fysiologische EF toonden ze zeer gericht cel migratie naar de kathode (figuur 1). Hetzelfde is ook een enkele cel niveau op de organotypische ruggenmerg slice ex vivo model een 3D milieu nabootsend in vivo omstandigheden (figuur 2).
Figuur 1. NPC's tonen gericht migratie in EFS. PC heeft zeer gericht migratie naar de kathode bij blootstelling aan EF, rode en blauwe lijnen pijlen trajecten en richting van celverplaatsing (A). B toont de migratieroutes van NPCs. Bar: 50 urn.
Figuur 2. Getransplanteerde NPC's tonen gericht migratie naar de kathode in de organotypische ruggenmerg slice
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De protocollen die we gebruiken zijn gebaseerd op eerdere studies 5,11. Met behulp van deze methoden, stabiele cultuur en elektrische huidige omstandigheden kan worden gehandhaafd, terwijl het aanbrengen van een EF via agar bruggen, Steinberg's oplossing en Ag / AgCl elektroden, om cellen of schijfjes gekweekt in speciaal ontworpen electrotactic kamers van gestandaardiseerde en nauwkeurige afmetingen. De diepte van kamers kan worden aangepast aan geschikt voor verschillende diktes monster 11 en bij cellen kamervolume kunnen worden gemodificeerd om tegemoet hoeveel cellen zijn (bijv. Western blot analyse vereist vele cellen). Wij hebben aangepast en ontwikkeld deze methoden om procedures die niet technisch mogelijk is om cellen te volgen in vivo met behulp van time-lapse-opname op een enkele cel-niveau mogelijk te maken. Het merendeel van de eerder onderzoek van cellulaire respons op EF, is uitgevoerd in 2D omgevingen. De in vivo studie van de respons van NPC electrotactic een enkele cel niveauzou cruciaal bewijs voor een fysiologische relevantie te onderbouwen. Dit is echter technisch zeer moeilijk te bereiken met de huidige techniek, vooral wanneer probeert real-time celmigratie opnamen verkregen. Wij hebben verdere stappen een ex vivo organotypische ruggenmerg slice cultuurmodel stellen, nauw nabootsen van de in vivo milieu waaruit blijkt dat cellen nog een electrotactic reactie in een 3D omgeving bezitten, zoals weergegeven in figuur 2. Deze methode kan ook geschikt voor het waarnemen van de effecten van EF een groot aantal celtypes in een organotypische 3D milieu, zoals wondgenezing epitheelweefsel angiogenese in de aorta ring of kuiken CAM en eventueel genetische effecten in het kippenembryo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Royal Society URF subsidie UF051616, Verenigd Koninkrijk en de European Research Council StG subsidie 243.261 tot BS. Het werk in MZ lab wordt ook ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde subsidie RB1-01417.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-basic Recombinant Human | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng/mL |
| EGF Recombinant Human | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng/mL |
| N2-Supplement (100X) liquid | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 medium (high glucose) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poly-D-Lysine | EMD Millipore | A-003-E | |
| Natural mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Growth factor reduced Basement Membrane Matrix (Matrigel) | BD Biosciences | 354230 | |
| HEPES buffer | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
References
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
- Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord. PNAS. 77, 1209-1209 (1980).
- Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial. J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).
- Zhao, M., Song, B., Pu, J. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, 457-457 (2006).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).
- Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration. Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).
- Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Song, B., Gu, Y., Pu, j Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).
