Summary
Эта рукопись описывает три дополнительных протоколов для оценки токсичности полиглутаминовых (polyQ) расширение белка в дрожжах
Abstract
Неправильного фолдинга белков связано с многих заболеваний человека, в частности, нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона 1. Болезнь Хантингтона (HD) вызвано аномальной расширение полиглутаминовых (polyQ) область в белке Huntingtin. PolyQ расширенной Huntingtin белка достигает аберрантных конформации (т.е. misfolds) и вызывает цитотоксичность 2. По крайней мере, еще восемь нейродегенеративных заболеваний, вызванных polyQ-расширений, в том числе спиноцеребеллярной атаксии и болезнь Кеннеди 3.
Дрожжи модель организма способствовало значительное понимание клеточных и молекулярных основах polyQ токсичности, включая влияние внутри-и межмолекулярных факторов polyQ токсичности, а также выявление клеточных путей, которые обесценились в клетках, экспрессирующих polyQ расширения белки 3-8. Важныйют многие аспекты polyQ токсичности, которые были обнаружены у дрожжей были воспроизведены в других экспериментальных системах и в некоторой степени в образцах от больных HD, демонстрируя тем самым значение дрожжей модель для открытия основных механизмов, лежащих в основе polyQ токсичности.
Прямой и относительно простой способ определить, polyQ токсичности в дрожжи для измерения дефектов роста дрожжевых клеток выражения polyQ расширения белков. Эта рукопись описывает три дополнительных экспериментальных подходов к определению polyQ токсичности у дрожжей путем измерения роста дрожжевых клеток выражения polyQ расширения белков. Первые два экспериментальных подходов контролировать рост дрожжей на тарелки, третий подход контролирует рост жидких культур дрожжей использованием BioscreenC инструмента.
Кроме того, эта рукопись описывает экспериментальные трудности, которые могут возникнуть при работе с моделями дрожжи polyQ и определяет стратегии, которые помогут избежать илиминимизировать эти трудности. Протоколы, описанные здесь, могут быть использованы для идентификации и описания генетических путей и малых молекул, которые модулируют polyQ токсичности. Кроме того, описанные тесты могут служить в качестве шаблонов для точного анализа токсичности, вызванные другими заболеваниями, связанные неправильно упакованных белков в дрожжевой модели.
Protocol
1. Выражение токсичных PolyQ расширения белков у дрожжей
Систематический анализ установил точный аминокислотной последовательности polyQ расширения белка, необходимого для производства токсичности дрожжи 7. Этот токсичный polyQ расширения белок содержит амино-терминал FLAG-теги следуют 17 аминокислот из исходной последовательности белка Huntingtin, регион polyQ и карбокси-терминал слияние с флуоресцентным белком (GFP либо или CFP, см. рисунок 1 а). Экспрессии белков с polyQ расширения 46 глутаминовой или более (например, 72 и 103 глутаминовой) производит токсичности у дрожжей при выраженных под контролем индуцируемого и относительные сильные GAL1 промоутер 7, 9.
Как описано выше, polyQ токсичности у дрожжей является лишь кажущимся в клетках, которые несут белок Rnq1p в прион конформации [RNQ +], например, штамм дрожжей W303 9. Токсичных polyQ расширения белка тecapitulates центральных аспектов polyQ-биологии дрожжей, таких как polyQ длина зависит от токсичности (см. ниже) и агрегации (рис. 1 б). Примечательно, что токсичные polyQ расширения белки не убить дрожжевые клетки немедленно, они скорее ухудшают или арест клеточного цикла и клеточной деление, тем самым замедляя или подавляя рост дрожжевых колоний на пластинах или жидкой культуры (наши неопубликованные данные).
2. Потенциальные проблемы с дрожжевой клетки, экспрессирующие Токсичные PolyQ расширения Белки
Дрожжевые клетки выразить иначе токсичные белки polyQ расширение не может показать любой дефект роста 9. Генетическая природа этих супрессоров polyQ токсичности, кажется, не основывается на простой менделевской мутаций и, следовательно, может происходить с относительно высокой частотой (наши неопубликованные результаты). Мы полагаем, что эти спонтанные супрессоров вызваны отверждения неизвестных прионов, которые функционируют аналогично [RNQ +] в определении polyQ toxicity.Thesэлектронной спонтанного супрессоров токсичности polyQ может поставить под угрозу успешное проведение любого эксперимента, целью которого является характеризуют polyQ токсичности или чтобы определить и охарактеризовать модификаторов токсичности polyQ.
Для того, чтобы избежать частого появления этих спонтанных супрессоров, следуют меры предосторожности, изложенные ниже, которые оказались очень эффективными:
- Используйте свежие дрожжевых клеток на токсичность экспериментов. Не хранить дрожжи в течение длительных периодов времени. Часто получить свежие колонии дрожжей из замороженных запасов.
- Часто контролировать выражение и агрегирование токсичных polyQ расширения белки флуоресцентной микроскопии.
- Держите дрожжевых клеток в средствах массовой информации, которые подавляют экспрессию токсичных токсичности polyQ в любое время (т.е. в селективной среде, содержащей глюкозу в качестве единственного источника углерода) перед началом любого измерения токсичности.
- Используйте как минимум три независимых трансформантов для каждого polyQ токсичности эксперимента. </ LI>
3. Рост Анализы
- Для каждого экспериментальных условиях, привить одной колонии каждого из трех независимых трансформантов дрожжевых клеток, несущих токсичных polyQ расширения белка в 3 мл селективной среде дрожжей с глюкозой в качестве единственного источника углерода.
- Инкубируйте этих культур в течение ночи при 30 ° C. В этих условиях клетки не выражает polyQ расширения белка, так как глюкоза в среде подавляет их выражения. Не позволяйте этим культурам зарастают; сохранить OD 600 (поглощение света 600 нм) в ночь культур ниже 1.
- Мы обычно используют три различных тестов для контроля дефектов роста дрожжевых клеток, экспрессирующих токсичных polyQ расширения белка:
3,1 Рост на пластинах
- Разведите ночью культуры дрожжей (выросла с 220 оборотов в минуту тряски) для OD 600 0,0005 (то есть разведение 1:1000 OD600 = 0,5 культуры) в избирательный менядиаметр 7, содержащий глюкозу.
- Равномерно распределены по 50 мкл (в результате ок. 700 колоний на пластину) каждого разведенного культуры на одной пластине (10 см в диаметре) с селективной среде, содержащей глюкозу в качестве единственного источника углерода и одну пластину с селективной среде, содержащей галактозы в качестве единственного источника углерода.
- Инкубируйте пластины для трех-четырех дней при температуре 30 ° C. После инкубации сфотографировать каждую тарелку и подсчитать число колоний на глюкозу и число колоний на галактозу пластин. В идеальных условиях, не должно быть никаких или лишь очень немногие колонии на галактозу пластины при использовании дрожжевых клеток в высшей степени токсичны polyQ расширения белка (103Q, рис. 2а).
3,2 Зрительные тесты
Этот анализ более чем количественный анализ покрытий описано выше, и таким образом выявить даже незначительные различия в polyQ токсичности с такой же эксперимент на той же пластинке.
- Развести overnIGHT культур, выращенных в среде с глюкозой для OD 600 0.1.
- Внесите 200 мкл разбавленной этих культур в стерильных 96-луночных планшетах и подготовить пять пять раз серийных разведений в стерильной воды с помощью многоканальной пипетки.
- Использование Frogger, (также называемый наблюдатель, 8 х 6 контактов для передачи клеточных суспензий), передает клеточные суспензии на чашки, содержащие селективной среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода и чашки, содержащие селективных средах с галактозы в качестве единственного источника углерода.
- Позвольте пластин высохнуть, прежде чем их инкубации при температуре 30 ° C в течение трех-четырех дней.
- После инкубации сфотографировать каждую пластину (рис. 2б).
3.3. Мониторинг polyQ токсичности дрожжи ростом жидких культур
Этот протокол является наиболее количественных (OD600 номеров) из трех тестов, описанные здесь, и может даже обнаружить очень тонкие различия в токсичности polyQ. Указанные осcurrence спонтанных супрессоров, тем не менее, потенциально может производить ошибочные результаты. Поэтому я рекомендую сочетание данного анализа, по крайней мере один из двух покрытий анализов, описанных выше. Мы предлагаем использовать BioscreenC инструмент для этих экспериментов. BioscreenC является инструментом, который автоматически измеряет оптическую плотность культур дрожжей в 100-луночных время выдерживают при определенных температурах с определенным волнением. Другие методы для выращивания дрожжевых клеток и измерение их оптической плотности могут также применяться.
- Вымойте дрожжевых клеток от минимальной среде, содержащей глюкозу в качестве единственного источника углерода в три раза в 3 мл стерильной воды.
- Разведите ночью культур, выращенных в среде с галактозой к OD 600 0.1.
- Заполните каждую лунку 100-а BioscreenC пластины с 300 мкл дрожжевых культур.
- Откройте Easy Bioscreen программа эксперимента. Определить количество образцов вы хотите контролировать (включая пробелы и среднего толькоуправления), установить температуру до 30 ° C, установить продолжительность эксперимента до 3 дней, установить интервалы измерений до 15 минут, установить фильтр на 600 нм / Браун, и установите режим встряхивания до 15 секунд перед каждым измерением в средней силы.
- BioscreenC инструмент и прилагаемый к нему программное обеспечение будет производить Excel таблиц каждой точки данных, принятых в ходе эксперимента.
- Подготовить кривые роста с Excel для каждого образца и сравнить рост различных образцов (рис. 2). Подробное описание анализа данных, полученных BioscreenC экспериментов была предоставлена до 10.
4. Представитель Результаты
Рисунок 1. Модель дрожжи polyQ. а) Схематическое изображение токсичных polyQ расширения белка. б) Флуоресцентная микроскопия показывает дрожжевые клетки выразить словами, нетоксичные polyQрасширение белка (25Q, левая панель) и дрожжевых клеток выразить долго, токсичных polyQ расширения белка (103Q, правая панель).
Рисунок 2. Представитель результаты анализов рост дрожжевых клеток, экспрессирующих polyQ расширения белков. а) покрытие анализа. Около 700 дрожжевые клетки были разбросаны по тарелкам и инкубировали в течение трех дней при температуре 30 ° C. Верхняя панель показывает пластины, содержащей глюкозу среде, то есть выражение токсичных polyQ расширения белка (103Q) не индуцируется. Нижняя панель показывает дрожжи пластины, содержащей галактозы среды, то есть выражение токсичных polyQ расширения белка индуцированные. Отметим, что в эксперименте показано здесь, не спонтанное супрессоров произошло. Б) Зрительные анализа. Пять серийных пять раз разведения дрожжевой клетки укрывательство или нетоксичных polyQ белка (25Q) или токсичных polyQ расширения Протейп (103Q) были замечены на глюкозу пластин, которые подавляют экспрессию белков (левая панель) или галактозы плит, которые вызывают их выражения. Затем планшеты инкубировали в течение трех дней при температуре 30 ° С. С) BioscreenC эксперимента. Рост культур клеток дрожжей выражения или нетоксичных polyQ белка (25Q) или токсичных polyQ расширения белка (103Q) были под наблюдением BioscreenC инструмента. Условия эксперимента и анализа BioscreenC эксперименты описаны в основном тексте.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта рукопись выделяет три дополнительных экспериментальных подходов для измерения polyQ токсичности в организме дрожжей модель основана на снижение роста дрожжевых клеток выражения токсичных polyQ расширения белков. Работа в дрожжах предлагает глубокое понимание основных клеточных и молекулярных механизмов сворачивания белка и его последующей токсичности, в том числе неправильного сворачивания и токсичности polyQ расширения белков 9,11,12. Эксперименты на основании протоколов, представленные здесь уже помогли выявить и охарактеризовать генетические усилители или подавители токсичности polyQ, небольшие молекулы модификатора токсичности polyQ и клеточные механизмы, лежащие в основе polyQ токсичности 5-8,13,14.
Представленные протоколы могут быть легко адаптированы для изучения других модификаторов polyQ токсичности, таких как различные условия роста или генетических мутаций, которые либо уменьшить или усилить polyQ токсичности. Кроме того, представлен экспериментальный протоколможно легко настроить для проверки токсичности других токсичных неправильно упакованных белков в дрожжах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа в Duennwald лаборатории при поддержке грантов от американской федерации исследований старения (АФАР), наследственные болезни фонд (ХДФ) и Уильям древесины Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frogger (6x8 pins) | V&P Scientific | VP 407 AH | |
| BioscreenC | Growth Curves USA | 5101370 | |
| 100-well Honeycomb plates | Growth Curves USA | 9602550 |
References
- Soto, C., Estrada, L. D.
- Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).
- Zoghbi, H. Y., Orr, H. T.
- Meriin, A. B. Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains. FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).
- Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease. Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).
- Duennwald, M. L., Lindquist, S. Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity. Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).
- Meriin, A. B. Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).
- Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells. J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).
- Gitler, A. D. Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease. Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Giorgini, F., Muchowski, P. J. Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast. Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).
- Ehrnhoefer, D. E. Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models. Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).
