Summary
우리의 프로토콜은 홈 개선 스토어에서 구입 재활용 Invitrogen Nupage Novex minigel 카세트, 그리고 저렴한 재료로 한 번에 여러 개의 단백질 젤을 부어하는 방법을 보여줍니다. 이것은 경제적이고 능률적인 방법은 몇 주 동안 4 ° C에서 젤을 저장하는 방법을 포함하고 있습니다. 상용 젤, 자주 단백질 젤을 실행 실험실에서 플라스틱 겔 카세트를 다시 사용함으로써 상당한 비용을 절약하고 환경에 도움을 줄 수 있습니다.
Abstract
나트륨 dodecyl 황산염의 polyacrylamide 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 분석을 사용하여 단백질의 평가는 생화학 및 분자 생물학 연구 1-4에서 사용하는 일반적인 기법입니다. 단백질의 일상 분석을 수행하는 실험실의 경우 상용 polyacrylamide의 젤 (~ $ 10/gel)의 비용은 시간의 경과에 상당한 될 수 있습니다. 이 비용을 완화하기 위해 일부 연구자들은 자신의 polyacrylamide 젤을 준비합니다. 이러한 젤류를 따르고 전통적인 방법은 일반적으로 전문 장비와 비용이 많은 젤류를 따르고과 향후 사용을 위해 그들을 저장할 수 있습니다 배제 유리 겔 접시를 사용합니다. 또한, 붓는 청소 또는 젤 동안 유리 조각으로 취급하는 것은 대학 연구실 교실에서 자신들의 사용을 배제 있습니다 안전 위험을 작성, 우발적인 파손이 발생할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 재활용 Invitrogen Nupage Novex minigel 카세트에 의해 동시에 여러 단백질 젤을 잡다, 그리고 저렴한 mA하는 방법을 보여줍니다terials는 인테리어 가게에서 구입했습니다. 이것은 경제적이고 능률적인 방법은 몇 주 동안 4 ° C에서 젤을 저장하는 방법을 포함하고 있습니다. 상용 젤, 자주 단백질 젤을 실행 실험실에서 플라스틱 겔 카세트를 다시 사용함으로써 상당한 비용을 절약하고 환경에 도움을 줄 수 있습니다. 또한, 플라스틱 겔 카세트는 학부 실험실 교실에 이상적하게 파손에 매우 저항력이 있습니다.
Protocol
1. 카세트를 준비
- 클린 앞면과 뒷면 사용 Invitrogen Nupage Novex minigel 카세트, 또는 기타 상업적 minigel 카세트의 접시.
- 플라스틱 에폭시의 약 1-3 ML을 준비하고 제조 업체의 지시에 따라 잘 섞는다.
- 카세트가 조립되면 두 접시가 접촉되는 전면 판의 안쪽 가장자리에 에폭시를 적용합니다.
- 오프닝을 막기에서 초과 에폭시을 방지하기 위해 카세트를 조립하면 다시 접시의 바닥 슬릿을 통해 필터 종이 또는 판지의 조각을 밀어 넣습니다. 즉시 두 접시가 조립되는대로 필터 종이를 제거합니다.
- 꽉 도장을위한 가장자리를 따라 바인더 클립을 놓고 카세트가 완전히 치료 에폭시를 위해 하룻밤 사이에 앉자.
- 전기 테이프로 다시 접시의 바닥에 슬릿을 봉쇄해.
2. 해결 젤을하고 있는걸
- 125 ML 사이드 암 플라스크에 다음을 추가합니다4X 트리스 - 자료 해결 젤 버퍼 산도 8.70, 30.8 %의 아크릴 아미드 / bisacrylamide의 3.50 ML, 유형 3.25 ML의 2.25 ML 9 ML의 총 부피를 위해서 시약 학년 물 (IRG-H 2 O).
- 드 가스 진공 장치로 플라스크의 측면 팔을 부착하고, 플라스크의 상단에 거꾸로 마개를 삽입하여 10 분, 대한 솔루션입니다.
- 50 ML 일회용 폴리 프로필렌의 원심 관에 드 기름 솔루션의 9 ML 전송 30 10 % ammounium의 persulfate (APS)의 μl와 N의 μl 6, N, N ', N'- tetramethylethylenediamine (TEMED)와 믹스를 추가 거품을 도입 피하기 위해 솔루션을 소용돌이에 의해 잘.
- 바로 그것이 겔 접시 사이에 형성에서 모든 거품을 방지하기 위해 카세트의 측면을 실행할 수 있도록 카세트에 솔루션을 붓는다. 앞면 (짧은) 접시의 맨 가장자리에서 약 2cm로 카세트를 채우십시오.
- 부드럽게 1X 해결 겔 버퍼로 포화 1-butanol 0.5 ML을 추가하고 젤은 1 중합하자시간.
3. 스태킹 젤을하고 있는걸
- 4X 트리스베이스 스태킹 겔 버퍼 산도 6.80, 30.8 %의 아크릴 아미드 / bisacrylamide의 0.40 ML, 3 ML 총 볼륨 IRG-H 2 O의 1.85 ML의 0.75 ML : 125 ML 사이드 암 플라스크에 다음을 추가합니다.
- 드 가스 단계는 2 단계에 설명된대로 10 분, 대한 솔루션입니다.
- 스태킹 겔 솔루션 degassing되는 동안 해결 젤 상단에서 1X 해결 젤 버퍼로 포화 1-butanol을 붓는다. IRG-H 2 O를 함께 한 해결 젤의 상단을 씻어 물을 붓고하고 남은 액체를 흡수하기 위해 물을 빨아들이는이나 워트 먼지 필터 용지를 사용합니다.
- 당신의 degassed 솔루션 3 ML을 제거하고 10 %의 APS와 TEMED 2 μl 9 μl를 추가하고 잘 섞는다.
- 신속하게 그것이 짧은 프런트 겔 판의 상단 가장자리 근처에까지 그것이 카세트의 측면을 실행할 수 있도록 카세트에 솔루션을 붓는다.
- , 겔 카세트 상단으로 클린 겔 빗을를 삽입그 장소에서 개최 빗 위에 카세트에서 바인더 클립을 넣으십시오. 스태킹 겔은 하룻밤 사이에 1 시간 동안 중합하자.
4. 젤 저장
- 겔 완전히 polymerized되면 바인더 클립을 제거하고 열을 sealable 플라스틱 주머니에있는 카세트, 또는 다시 sealable 비닐 봉투를 넣습니다.
- 주머니에 0.1 %의 나트륨 azide를 포함 1X 스태킹 겔 버퍼 20 ML 하거라.
- 5 초 동안 주머니를 밀봉하고 봉투에는 누수가 없는지 확인 열정.
- 4 ° C.에서 젤을 저장
5. 샘플 준비
- 얇은 벽으로 둘러싸인 microcentrifuge 튜브에서 단백질 샘플의 6.5 μl, 대한 2X Novex 트리스 - 글리신 SDS 샘플 버퍼, 100 MM dithiothreitol (DTT)과 IRG-H 2 O 1 μl (필요한 경우) 7.5 μl에 추가 15 μl의 총 부피.
- vortexing하여 샘플을 섞어서하고, 간략하게 튜브의 바닥에 내용을 가져 샘플을 원심 분리기. <리> 변성 70 샘플 ° C ~ 10 분입니다.
6. 젤 실행하기
- Novex 겔 장치를 설정합니다.
- 내부 챔버에 Nupage 항산화 500 μl, 그리고 트리스 - 글리신은 바깥 실로 버퍼를 실행하면 300 ML을 포함 트리스 - 글리신 나오는 버퍼 200 ML을 추가합니다.
- 겔로드 피펫 팁을 사용하는 우물에 변성 단백질 샘플 (15 μl)을로드합니다.
- 60-70 분 200 V에서 젤을 실행합니다.
7. 젤 염색법
- 겔 장치에서 카세트를 제거하고 겔 나이프 또는 빳빳한 퍼티 나이프를 사용하여 별개의 두 플라스틱 겔 접시를 떼어 내려고하면 에폭시 도장을 깰. 젤 찢어하지 않도록 돌보는 접시에서 젤을 조심스럽게 분리.
- IRG-H와 젤 부드러운 선동 2 O를 세 번 씻어.
- 부드러운 교반과 1 시간 Invitrogen SimplyBlue SafeStain와 젤 청바지.
- 염색법 솔루션을 붓고IRG-H 2 O를 가진 젤 destain
8. 카세트 청소
- 그들이 다시 재사 용할 수 있도록 카세트의 모든 에폭시 긁어서거나 껍질하는 금속 주걱을 사용합니다.
- 순한 세제 용액으로 플라스틱 겔 접시 각각 씻어하고, 증류수 다음 수돗물로 잘 씻어.
9. 대표 결과
에폭시가 물 방지 시일 (그림 1)을 형성하므로, 카세트는 아크릴 아미드 솔루션은 그들에 부어 때 누출되지 않습니다. 또한, 겔 카세트 쉽게 염색법을위한 젤을 검색할 열 수 있으며 에폭시들은 지속적인 재사용을 허용하기 위해 카세트 놔 벗겨 수 있습니다. 그림 2에 표시된 바와 같이, 젤은 단백질 마커와 일상 단백질 전기 영동에 적합한 샘플 밴드의 명확한 분리를 보여줍니다.
1 그림. Appliminigel 카세트를 봉인하기 위해 에폭시의 양이온이. 에폭시의 박막 층을 조립 이전 카세트 중 하나의 가장자리에 적용됩니다. 에폭시를 강조하기 위해서는 해당 이미지의 허위 - 붉은 색이었다.
그림 2. SDS-트리스 - 글리신 젤의 단백질의 분리는 다시 사용 minigel 카세트를 사용하여 부어. 위에서 설명한대로 SDS-PAGE이 수행되었다. 다음은 전기 영동은 겔이 제조 업체의 지침에 따라 SimplyBlue SafeStain으로 물들일 minigel 카세트, 제거 및 전송 하얀 빛을 이용하여 촬영되었다. 레인 M은 SeeBlue Plus2 사전 묻은 단백질 표준을 포함하고 있습니다. 차선 M의 단백질의 분자 무게는 kilodaltons (kDa)에서 젤 오른쪽에 표시됩니다. 다른 차선은 글루타티온-S-transferase (GST) - 태그가 단백질을 표현 박테리아로부터 허가 lysate에서 단백질을 보여줍니다. 표시된 단백질은 g에서 씻어 복이 있나니GST-태그를 단백질의 용출 이전 lutathione 비즈.
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Discussion
단백질 겔 전기 영동은 대부분의 분자 생물학 연구소를위한 indispensible 방법입니다. 상용 minigels의 편의를 높은 수준을 제공하지만, 치명타가 될 수 있습니다. 여기 상용 minigels의 인기 브랜드에서 minigel 카세트를 다시 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 젤의 기성품 소스를 가지고있는 편리함을 유지하지만, 상용 minigels 비용의 분수에. 이 절차의 주요 단계는 완전히 유출을 방지하기 위해 unpolymerized 아크릴 아미드를 추가하기 전에 카세트를 봉인하기 위해 에폭시의 정확한 금액을 적용합니다. 플라스틱에 대한 평가에만 에폭시를 사용하여 제조 업체의 지침에 설명된대로 에폭시의 중합을위한 충분한 시간을 허용합니다. 추가 편의를 위해 여러 개의 카세트은 봉인된 수 있으며 사전 젤류 따르는 저장됩니다. 해결 젤 붓는 경우, T의 높이보다 일반적으로 약 0.5 cm 이상 스태킹 젤 충분한 공간을 두십시오우물을 형성하는 데 그 보겠습니다. 해결 겔의 중합하는 동안, 버퍼 포화 1-butanol이 해결 젤 위에 형성 직선, 평면을 형성한다는 겔은 직립 등 유지. 겔 30 분 이내에 중합하지 않을 경우 10 % APS와 TEMED의 금액이 증가 수 있습니다. 겔이 실행 완료되면 조심스럽게 얇은 젤 리핑 방지하기 위해 에폭시 도장을 아프게하는 것이 중요합니다. 방법은 다시 사용하는 상용 겔 카세트 것은 자주 SDS-PAGE 사용과 관련된 상당한 비용을 절약할 수로 여기에보고했다. 동일한 카세트는 년간 재사용과 우리가 같은 카세트의 반복 사용은 그들의 가용성을 감소한다는 증거가 없음을 수 있습니다. 또한, 여러 젤은 0.1 %의 나트륨 azide가 포함된 1X 스태킹 겔 버퍼의 소량을 포함하는 폴리 에스테르 배리어 필름 가방에 주 동안 준비하고 저장할 수 있습니다.
약어 :
Dithiothreitol (DTT), N, N, N ', N'- tetramethylethylenediamine (TEMED)는, 내가 시약 학년 물 (IRG-H2O), ammounium의 persulfate (APS), 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS), 트리스 (히드록시 메틸) aminomethane (트리스베이스), N, N'-메틸렌 - 비스 - 아크릴 아미드를 (BIS 입력 - 아크릴 아미드)
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 AH에 생명 수상 University of Florida의 과학 하워드 휴즈 의학 연구소 감사
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
References
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
