Summary
我们的协议演示如何倒在时间的多种蛋白质凝胶回收Invitrogen公司Nupage NOVEX微小胶体录音带，并在家装商店购买廉价的材料。这种经济和精简的方法，包括了几个星期的方式储存在4°C凝胶。通过重新使用塑料胶盒从市售凝胶，实验室运行频繁的蛋白凝胶可显着节省成本，并帮助环境。
Abstract
使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）分析蛋白质的评价是一种常见的技术，生物化学和分子生物学的研究人员1-4。执行每日蛋白质分析实验室，市售的聚丙烯酰胺凝胶（$ 10/gel）的成本可能是相当一段时间。为了降低成本，一些研究人员自己编写的聚丙烯酰胺凝胶。这些凝胶浇注的传统方法通常利用专门的设备和玻璃的凝胶板，可以是昂贵的，排除许多凝胶浇注和存储以供将来使用。此外，在清洗或浇注凝胶玻璃板处理可能会导致意外破损，创造一个安全隐患，这可能妨碍其使用在本科实验班。我们的协议演示如何同时倒入多个蛋白凝胶回收Invitrogen公司Nupage NOVEX微小胶体录音带，和廉价的马terials家装店购买。这种经济和精简的方法，包括了几个星期的方式储存在4°C凝胶。通过重新使用塑料胶盒从市售凝胶，实验室运行频繁的蛋白凝胶可显着节省成本，并帮助环境。此外，塑料胶录音带是极耐破损，这使得他们的本科生做实验教室的理想。
Protocol
1。准备磁带
- 清洁的正面和背面板使用Invitrogen公司Nupage NOVEX微小胶体录像带，或其他商业微小胶体录像带。
- 准备约1-3毫升的塑料环氧树脂，并根据制造商的指示，拌匀。
- 适用于环氧树脂内缘的前面板上，两个板块接触时，磁带装配。
- 通过背面板的底部缝滑入了一块过滤纸或纸板，装配时的录像带，以防止多余的环氧密封开幕。取出滤纸，只要这两个板块组装。
- 将沿着一个密封的边缘粘结剂剪辑，并让磁带通宵坐在环氧树脂完全固化。
- 电工胶带背面板的底部密封的缝隙。
2。浇注胶
- 侧臂瓶125毫升，加入以下内容：我总体积为9毫升试剂级水（表意文字- H 2 O）的2.25毫升4X Tris碱分离胶缓冲液pH值8.70，30.8％，丙烯酰胺/双丙烯酰胺3.50毫升，3.25毫升类型。
- 德气体烧瓶的侧臂连接到一个真空装置，并放置在一个倒置的烧瓶上方塞10分钟的解决方案。
- 转移去瓦斯的解决方案，以50毫升的一次性聚丙烯离心管9毫升，并添加过硫酸铵（APS）的10％ammounium 30μL和6μL氮，氮，N“，N-四甲基乙二胺（TEMED）和混合纷飞的解决方案，以避免引入气泡。
- 立即倒入磁带的解决方案，允许它运行下来的录像带一侧，以防止形成凝胶板之间的任何气泡。录像带，以填补前（短）板的顶部边缘约2厘米。
- 轻轻地添加0.5毫升-1 - 丁醇饱和1X解决凝胶缓冲，让凝胶聚合1小时。
3。浇注浓缩胶
- 加入125毫升侧臂瓶：4X Tris碱浓缩胶缓冲液pH值6.80，0.40毫升30.8％丙烯酰胺/双丙烯酰胺，表意文字-H 2 O 1.85毫升3毫升的总量为0.75毫升以下。
- 德气体10分钟，如在第2步中所述的解决方案。
- 而脱气浓缩胶溶液，倒入1 - 丁醇与1X解析解决凝胶顶部的凝胶缓冲饱和的。一旦与表意文字-H 2 O冲洗解决凝胶顶部倒掉水，并用吸水或滤纸滤纸吸收剩余的液体。
- 取出3毫升的脱气的解决方案，并添加9μl和10％APS和2μLTEMED拌匀。
- 很快倒在录像带上的解决方案，允许它运行录像带一侧，直到它附近的短前凝胶板的顶部边缘。
- 清洁凝胶梳插入凝胶盒的顶部，磁带上的粘合剂剪辑放置在梳举行到位。让浓缩胶聚合为1小时至过夜。
4。存储凝胶
- 当凝胶完全聚合，除去粘结剂剪辑，并放置在一个塑料袋热封的录像带，或重新密封的塑料袋。
- 倒入20毫升1X叠加凝胶缓冲区包含入袋0.1％的叠氮化钠。
- 热封袋为5秒，并确保有袋无泄漏。
- 储存在4°C凝胶
5。样品准备
- 在薄壁离心管中，加入6.5μL蛋白质样品，为7.5μl2X NOVEX Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液，1μL100毫米二硫苏糖醇（DTT）和表意文字-H 2 O（如有必要）的总体积15μL。
- 由涡旋混合样品，并短暂离心管底部带来内容的样本。 <李>变性的样品在70°C为10分钟。
6。运行凝胶
- 成立NOVEX凝胶仪器。
- 加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液200毫升，包含500μL的内宅Nupage抗氧化剂，和300毫升的Tris-甘氨酸缓冲的外室。
- 加载到使用凝胶加载枪头井的变性蛋白质样品（15μL）。
- 运行60-70分钟，200至五凝胶。
7。染色的凝胶
- 从凝胶仪器取出录像带，并打破由两个塑料凝胶板，除了用胶刀或硬油灰刀撬环氧树脂密封。仔细分离板胶，不撕凝胶照顾。
- 冲洗与表意文字- H凝胶2轻轻摇动3倍。
- 污渍轻轻摇动1小时Invitrogen公司SimplyBlue SafeStain为凝胶。
- 倒出染色液和脱色，凝胶与表意文字-H 2 O
8。清洁磁带
- 使用金属铲刮或关闭所有磁带环氧树脂剥离，使他们能够再次被重用。
- 每个塑料凝胶板用温和的洗涤剂溶液洗，自来水蒸馏水冲洗。
9。代表结果
因为环氧树脂会形成水密封，（图1），录音带不会泄漏时，丙烯酰胺溶液泼到他们。此外，凝胶录音带可以轻易打开凝胶染色检索，环氧树脂，可去皮的磁带，让他们继续再利用。正如图2所示，凝胶蛋白标记和样品带，适用于常规蛋白电泳显示清晰的分离。
图1。 APPLI阳离子环氧树脂密封微小胶体录音带。一个薄薄的一层环氧树脂应用到磁带的边缘装配前。为了突出环氧树脂，它是假色红色在这个形象。
图2。 SDS的Tris-甘氨酸凝胶的蛋白质分离浇微小胶体磁带重新使用SDS-PAGE进行如上所述。以下电泳凝胶取出沾满SimplyBlue SafeStain为制造商的指示，从微小胶体录像带，并拍下使用传送白光。巷中号包含SeeBlue Plus2预染蛋白标准。在车道中号的蛋白质的分子量道尔顿（kDa）的凝胶右侧上表示。其他车道显示清除从表达了谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标签蛋白的细菌裂解的蛋白质。所示的蛋白质洗净，从Glutathione珠GST标签蛋白洗脱之前。
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Discussion
蛋白质凝胶电泳是大多数分子生物学实验室不可或缺的方法。市售minigels提供了方便的较高水平，但可能是昂贵的。在这里，我们展示如何重新使用从的市售minigels的流行品牌的微小胶体录音带。此方法保留了方便，但有一个现成的凝胶源的市售minigels成本的一小部分。在此过程中的一个关键步骤是运用正确的金额环氧树脂完全密封录音带之前加入unpolymerized丙烯酰胺，以防止泄漏。只使用环氧树脂被评为塑料，环氧树脂的聚合足够的时间允许，在制造商的说明中所述。更加方便，可密封和多个磁带存储浇注凝胶前。解决凝胶浇注时，一定要留下足够的空间，浓缩胶，通常约为0.5厘米，高度比T他梳用来形成井。在解决凝胶的聚合，使凝胶直立缓冲区饱和1 - 丁醇，将形成一条直线，平坦的表面，形成解决凝胶顶部。如果凝胶不聚合在30分钟内，10％APS和TEMED量可能会增加。一旦凝胶运行完毕后，重要的是仔细打破环氧树脂密封，以防止剥开薄薄的凝胶。报道的方法重新使用商业凝胶录音带可以保存频繁使用的SDS-PAGE相关的成本。可重复使用相同的磁带多年，我们没有证据表明，重复使用相同的磁带，降低了其可用性。此外，多个凝胶可以编写和存储在聚酯阻隔薄膜袋含有少量的1X叠加凝胶含有0.1％的叠氮化钠缓冲星期。
缩写：
二硫苏糖醇（DTT），氮，氮，N“，N” - 四甲基乙二胺（操EMED），键入我试剂级水（表意文字-H2O）的，ammounium过硫酸铵（APS），十二烷基硫酸钠（SDS），三羟甲基氨基甲烷（Tris碱），氮，N'-亚甲基双丙烯酰胺（BIS丙烯酰胺）
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者感谢用友科学为生命奖霍华德·休斯医学研究所的啊
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
References
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
