Summary
Nosso protocolo demonstra como colocar o gel de proteínas múltiplas em um momento de reciclagem Invitrogen Nupage cassetes Novex minigel e materiais baratos comprados em uma loja da melhoria home. Este método económico e simplificado inclui uma forma de armazenar os géis a 4 ° C durante algumas semanas. Ao re-utilizando as cassetes de gel de plástico de géis disponíveis no mercado, laboratórios que funcionam géis de proteína freqüentes podem economizar custos significativos e ajudar o meio ambiente.
Abstract
A avaliação de proteínas utilizando dodecil sulfato de sódio em gel de poliacrilamida a análise de electroforese (SDS-PAGE) é uma técnica comum utilizado por pesquisadores Bioquímica e Biologia Molecular 1-4. Para laboratórios que realizam análises diárias de proteínas, o custo de géis de poliacrilamida comercialmente disponível (~ $ 10/gel) pode ser considerável ao longo do tempo. Para reduzir este custo, alguns pesquisadores preparar seus próprios géis de poliacrilamida. Os métodos tradicionais de verter estes geles tipicamente utilizar equipamento especializado e placas de vidro de gel que podem ser caros e impede vertendo géis muitos e armazená-los para uso futuro. Além disso, a manipulação de placas de vidro durante a limpeza ou gel vertendo pode resultar em quebra acidental criar um risco de segurança, que pode impedir o seu uso em classes de laboratório de graduação. Nosso protocolo demonstra como colocar o gel de proteínas simultaneamente pela reciclagem Invitrogen Nupage cassetes Novex minigel, e ma baratariais comprado em uma loja da melhoria home. Este método económico e simplificado inclui uma forma de armazenar os géis a 4 ° C durante algumas semanas. Ao re-utilizando as cassetes de gel de plástico de géis disponíveis no mercado, laboratórios que funcionam géis de proteína freqüentes podem economizar custos significativos e ajudar o meio ambiente. Além disso, cassetes de gel de plástico são extremamente resistentes à quebra, o que os torna ideal para salas de aula de laboratório de graduação.
Protocol
1. Preparando os cassetes
- Frente e verso limpo placas de um Nupage Invitrogen usado Novex cassete minigel, ou cassete minigel outro comercial.
- Preparar ml aproximadamente 1-3 de epóxi de plástico e misturar bem de acordo com as instruções do fabricante.
- Aplicar o epoxi para o bordo interior da placa frontal, onde as duas placas irá entrar em contacto quando a cassete é montado.
- Deslizar um pedaço de papel de filtro ou de papelão através da fenda inferior da placa traseira, quando a montagem da cassete para evitar excesso de epóxi de selagem da abertura. Remover o papel de filtro, logo que as duas placas são montados.
- Coloque grampos da pasta ao longo das bordas para uma perfeita vedação, e deixar que as cassetes sentar-se durante a noite para o epóxi para curar completamente.
- Selar a fenda na parte inferior da placa traseira com fita isolante.
2. Verter o gel resolver
- Para um frasco de 125 ml braço lado, adicione o seguinte:2,25 ml de Tris-Base de Dados de 4X Resolving gel tampão de pH 8,70, 3,50 ml de acrilamida 30,8% / bisacrilamida, 3,25 ml de Tipo I de água grau reagente (GIR-H2O) para um volume total de 9 ml.
- De-gás a solução durante 10 min, anexando o braço lateral do balão a um aparelho de vácuo, e colocando uma rolha invertido sobre o topo do frasco.
- Transferir a 9 ml de isentos de gases solução para um tubo de centrífuga de 50 ml descartável de polipropileno e adicionar 30 uL de persulfato de ammounium 10% (EPA) e 6 uL de N, N, N ', N', N-tetrametiletilenodiamina (TEMED) e misturar bem agitando a solução para evitar a introdução de bolhas.
- Imediatamente despejar a solução na cassete, permitindo que a correr para baixo do lado da cassete para evitar quaisquer bolhas de formar entre as placas de gel. Encher a cassete para cerca de 2 cm a partir da borda superior da placa (mais curto) da frente.
- Suavemente adicionar 0,5 ml de 1-butanol saturado com 1X tampão de gel de resolução e deixar que o gel polimerizar durante 1horas.
3. Verter o gel de empilhamento
- Adicionar o seguinte para um balão de 125 ml braço lateral: 0,75 ml de 4X tampão Tris pH-empilhamento de bases de gel de 6,80, 0,40 ml de acrilamida 30,8% / bisacrilamida, 1,85 ml de O 2 IRG-H para um volume total de 3 ml.
- De-gás a solução durante 10 min, como descrito no passo 2.
- Enquanto a solução de gel de empilhamento é desgaseificação, despeje o 1-butanol saturado com 1X tampão de gel de Resolving a partir do topo do gel de resolução. Lavar o topo do gel resolver uma vez com O. 2-H IRG Decantar a água e usar um papel absorvente ou filtro Whatman para absorver qualquer líquido remanescente.
- Remover 3 ml da sua solução desgaseif içada e adicionar 9 ul de APS 10% e 2 ul de TEMED e misturar bem.
- Rapidamente despejar a solução na cassete, permitindo que a correr para baixo do lado da cassete até que seja perto da borda superior da placa frontal curta de gel.
- Inserir um pente gel limpo no topo da cassete de gel,colocar um clipe de ligante sobre a cassete sobre o pente para manter no lugar. Deixe a gel de empilhamento polimerizar durante 1 hora para durante a noite.
4. Armazenar o gel
- Quando o gel foi completamente polimerizado, remover os grampos da pasta e colocar a cassete dentro de uma bolsa de calor-selável, plástico ou um saco de plástico re-selável.
- Introduzir 20 ml de 1X tampão de gel de empilhamento que contém azida de sódio a 0,1% para a bolsa.
- Sele a bolsa por 5 segundos e verifique se não existem vazamentos no saco.
- Armazenar o gel a 4 ° C.
5. Preparação das amostras
- Num tubo de microcentrífuga de paredes finas, adicionar até 6,5 uL de amostra de proteína, 7,5 ul de tampão de amostra 2x Novex Tris-Glicina de SDS, 1 ul de 100 mM de ditiotreitol (DTT) e IRG-H2O (se necessário) para uma volume total de 15 uL.
- Misturar a amostra em vórtice, e brevemente centrifugar a amostra para trazer o conteúdo para o fundo do tubo. <li> desnaturar a amostra a 70 ° C durante 10 min.
6. Executando o gel
- Configure o aparelho de gel Novex.
- Adicionar 200 ml de Tris-Glicina tampão de corrida que contém 500 uL de antioxidante Nupage para a câmara interior, e 300 ml de Tris-Glicina O tampão de corrida para a câmara exterior.
- Carregar as amostras de proteína desnaturadas (15 uL) para os poços, utilizando uma carga de gel ponta da pipeta.
- Executar o gel a 200 V durante 60-70 min.
7. A coloração do gel
- Remova a cassete do aparelho de gel e quebrar o selo epóxi por erguer as duas placas de gel de plástico separados utilizando uma faca de gel ou de uma espátula rígida. Cuidadosamente separar o gel a partir das placas, tendo o cuidado de não rasgar o gel.
- Lavar o gel com IRG-H2O três vezes com agitação suave.
- Corar o gel com Invitrogen SimplyBlue SafeStain durante 1 hora com agitação suave.
- Decantar a solução de coloração edestain o gel com O. 2-H IRG
8. Limpando as gavetas
- Use uma espátula de metal para raspar ou descascar todo o epóxi sobre as cassetes para que possam ser reutilizadas.
- Lava-se cada uma das placas de gel de plástico com uma solução de detergente suave, e lavar bem com água da torneira seguida por água destilada.
9. Os resultados representativos
Devido epoxi irá formar uma vedação estanque a água, (Figura 1), as cassetes não irá vazar quando a solução é vertida em acrilamida-los. Além disso, as cassetes de gel pode ser facilmente aberto para recuperar o gel para a coloração, eo epóxi pode ser retirada das cassetes para permitir a sua continuação reutilização. Como mostrado na Figura 2, o gel mostra nítida separação de marcadores proteicos e bandas amostra adequada para a electroforese de proteínas de rotina.
Figura 1. Aplicaçãocatião de epoxi para selar cassetes minigel. Uma fina camada de epóxi é aplicada à extremidade de uma das cassetes antes da montagem. Para realçar o epóxi, que era falso-cor vermelha nesta imagem.
Figura 2. Separação de proteínas sobre um gel de SDS-Tris-glicina vertida usando re-utilizados cassetes minigel. SDS-PAGE foi realizada como descrito acima. Após electroforese o gel foi removido do cassete minigel, coradas em SimplyBlue SafeStain como por instruções do fabricante, e fotografados utilizando luz transmitida branco. Pista M contém SeeBlue Plus2 padrões pré-corados de proteína. Os pesos moleculares das proteínas em pista M são indicados no lado direito do gel em quilodaltons (kDa). As outras pistas mostram as proteínas a partir de um lisado limpo a partir de bactérias que expressam uma glutationa-S-transferase de proteínas (GST)-etiquetado. As proteínas são indicados os lavada a partir do ggrânulos lutathione antes da eluição da proteína GST-etiquetado.
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Discussion
Eletroforese em gel de proteína é um método indispensável para laboratórios de biologia molecular mais. Minigels comercialmente disponíveis fornecer um elevado nível de conveniência, mas pode ser caro. Aqui nós mostramos como reutilizar as fitas minigel de uma popular marca de minigels disponíveis comercialmente. Este método retém a conveniência de ter uma fonte pronta de géis, mas a uma fracção do custo de minigels comercialmente disponíveis. Um passo chave neste processo está a aplicar a quantidade correcta de epoxi para selar completamente as cassetes antes da adição do acrilamida não polimerizada para evitar fugas. Use epoxi apenas que é avaliado para o plástico, e permitir o tempo suficiente para a polimerização do epóxido, tal como descrito nas instruções do fabricante. Para maior comodidade, cassetes múltiplos podem ser selados e armazenados antes de despejar os géis. Quando vertendo o gel de resolução, ter a certeza de deixar espaço suficiente para que o gel de empilhamento, tipicamente cerca de 0,5 cm mais do que a altura de tele pente usados para formar os poços. Durante a polimerização do gel de resolução, manter o gel na vertical tal que o tampão saturada de 1-butanol irá formar uma superfície, hetero plana para formar sobre a superfície do gel, a resolução. Se o gel não polimerizar dentro de 30 min, a quantidade de EPA 10% e TEMED pode ser aumentado. Uma vez que o gel de terminar a execução, é importante cuidadosamente quebrar o selo epoxi para evitar rasgando o gel fina. O método descrito aqui de re-utilizar cassetes de gel comercial pode poupar custos significativos associados com o uso de SDS-PAGE freqüente. As cassetes mesmos pode ser reutilizado por anos e não temos nenhuma evidência que o uso repetido do mesmo cassete reduz a sua usabilidade. Além disso, os géis múltiplas podem ser preparados e armazenados durante semanas em um saco de filme de poliéster barreira contendo uma pequena quantidade de 1X tampão de gel de empilhamento contendo 0,1% de azida sódica.
Abreviaturas:
Ditiotreitol (DTT), N, N, N ', N', N-tetrametiletilenodiamina (TEMED), Tipo I de água grau reagente (GIR-H2O), ammounium persulfato (APS), sulfato de sódio dodecilo (SDS), Tris (hidroximetil) aminometano (Tris-base), N, N'-metileno-bis-acrilamida (bis -acrilamida)
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Instituto Médico Howard Hughes para uma ciência UF para a concessão de Vida para AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
References
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
