Summary
Ons protocol legt uit hoe meerdere eiwitten gels gieten in een tijd van recycling Invitrogen Nupage Novex MiniGel cassettes, en goedkope materialen die zijn aangeschaft bij een bouwmarkt te vinden. Deze voordelige gestroomlijnd werkwijze omvat een manier om de gels bewaren bij 4 ° C gedurende enkele weken. Door hergebruik van kunststof gel cassettes uit de handel verkrijgbare gels, laboratoria dat frequent eiwit gels draaien kan besparen aanzienlijke kosten en help het milieu.
Abstract
De evaluatie van eiwitten met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide-gelelektroforese (SDS-PAGE) analyse een techniek die door biochemie en moleculaire biologie onderzoekers 1-4. Voor laboratoria die de dagelijkse analyses van eiwitten uit te voeren, kunnen de kosten van in de handel verkrijgbare polyacrylamidegels (~ $ 10/gel) aanzienlijk zijn in de tijd. Om deze kosten te beperken, sommige onderzoekers bereiden hun eigen polyacrylamide gels. Traditionele methoden van het gieten van deze gels meestal gebruik maken van gespecialiseerde apparatuur en glas gel platen die kunnen duur zijn en weg te gieten veel gels en op te slaan voor toekomstig gebruik. Bovendien kan de behandeling van glazen platen bij het schoonmaken of gel gieten resulteren in een onvoorziene breuk het creëren van een gevaar voor de veiligheid, waarin het gebruik ervan kan zich verzetten tegen in undergraduate laboratorium klassen. Ons protocol legt uit hoe meerdere eiwitten tegelijk gels giet door recycling Invitrogen Nupage Novex MiniGel cassettes, en goedkoop materialen gekocht bij een bouwmarkt te vinden. Deze voordelige gestroomlijnd werkwijze omvat een manier om de gels bewaren bij 4 ° C gedurende enkele weken. Door hergebruik van kunststof gel cassettes uit de handel verkrijgbare gels, laboratoria dat frequent eiwit gels draaien kan besparen aanzienlijke kosten en help het milieu. Daarnaast plastic gel cassettes zijn uitermate bestand tegen breuk, waardoor ze ideaal zijn voor undergraduate laboratorium klaslokalen.
Protocol
1. Voorbereiden van de cassettes
- Schoon voor-en achterkant platen van een gebruikte Invitrogen Nupage Novex MiniGel cassette, of andere commerciële MiniGel cassette.
- Bereid ongeveer 1-3 ml kunststof epoxy en meng goed volgens de instructies van de fabrikant.
- Breng de epoxy aan de binnenzijde van de voorplaat, waarbij de beide platen in aanraking komen, wanneer de cassette is gemonteerd.
- Schuif een stuk filtreerpapier of karton door de bodem spleet van de achterplaat montage van de cassette om overmaat epoxy voorkomen afdichten van de opening. Het filtreerpapier zodra de twee platen zijn gemonteerd.
- Plaats bindmiddel clips langs de randen voor een goede afdichting, en laat de cassettes zitten 's nachts voor de epoxy om volledig te genezen.
- Sluit de sleuf aan de onderkant van de achterplaat met isolatietape.
2. Het gieten van de gel het oplossen van
- Om een 125 ml zijarm kolf, voeg het volgende:2,25 ml van de 4X Tris-Base Oplossen gel buffer pH 8,70, 3,50 ml van 30,8% acrylamide / bisacrylamide, 3,25 ml Type I reagenskwaliteit water (IRG-H 2 O) voor een totaal volume van 9 ml.
- De-gas de oplossing gedurende 10 minuten door het aanbrengen van de zijarm van de kolf met een vacuuminrichting en plaatsen van een omgekeerde stop op de top van de kolf.
- Breng de 9 ml ontgast oplossing 50 ml disposable polypropyleen centrifugebuis voeg 30 pl 10% ammounium persulfaat (APS) en 6 ul van N, N, N ', N',-tetramethylethyleendiamine (TEMED) en meng goed door omzwenken de oplossing te voorkomen dat er blaasjes.
- Onmiddellijk giet de oplossing in de cassette, waardoor het te lopen langs de zijkant van de cassette om luchtbelletjes te voorkomen de vorming van de gel platen. Vul de cassette op ongeveer 2 cm van de bovenrand van de voorste (kortere) plaat.
- Voorzichtig 0,5 ml 1-butanol verzadigd met 1X oplossing gel buffer en laat de gel polymeriseren van eenuur.
3. Gieten de stackinggel
- Voeg de volgende een 125 ml kolf zijarm: 0,75 ml van 4x Tris-base stackinggel buffer pH 6,80, 0,40 ml van 30,8% acrylamide / bisacrylamide, 1,85 ml IRG-H 2 O een totaal volume van 3 ml.
- De-gas de oplossing gedurende 10 min zoals beschreven in stap 2.
- Hoewel de stackinggel oplossing ontgassen, giet het 1-butanol verzadigd met 1X oplos gel buffer van de bovenkant van het oplossend gel. Spoel wanneer de bovenkant van de oplossing gel met IRG-H2O Giet het water af en gebruik maken van een aan de drank verslaafd of Whatman filtreerpapier om de resterende vloeistof op te vangen.
- Verwijder de 3 ml van uw ontgaste oplossing en voeg 9 pl van 10% APS en 2 pl TEMED en meng goed.
- Snel giet de oplossing in de cassette, waardoor het te lopen langs de zijkant van de cassette totdat het in de buurt van de bovenkant van de kortere voorkant gelplaat.
- Plaats een schone gel kam in de top van de gel cassette,plaats een bindmiddel clip op de cassette op de kam zijn plaats te houden. Laat de stackinggel polymeriseren gedurende 1 uur een nacht.
4. Opslag van de gel
- Wanneer de gel volledig is gepolymeriseerd, verwijder het bindmiddel clips en plaats de cassette in een warmte-afsluitbare plastic zakje, of een hersluitbare plastic zak.
- Breng 20 ml 1X stackinggel buffer die 0,1% natriumazide bevat in het zakje.
- Verhit verzegelen de buidel voor 5 sec en of er geen lekken in de tas te maken.
- Bewaar de gel bij 4 ° C.
5. De voorbereiding van de monsters
- In een dunwandige microcentrifugebuisje op tot 6,5 pl proteïnemonster, 7,5 ul 2x Novex Tris-glycine SDS-monsterbuffer, 1 pi 100 mM dithiothreitol (DTT) en IRG-H 2 O (indien nodig) om een totale volume van 15 pi.
- Meng het monster door vortexen, en kort gecentrifugeerd monster inhoud naar het einde van de buis. <li> denatureren van het monster bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
6. Het uitvoeren van de gel
- Stel de Novex gel apparaat.
- 200 ml Tris-glycine running buffer 500 ul Nupage antioxidant de binnenkamer en 300 ml Tris-glycine loopbuffer de buitenste kamer bevat.
- Laad het gedenatureerde eiwit monsters (15 ul) in de putten met behulp van een gel laden pipetpunt.
- Voer de gel bij 200 V voor 60-70 min.
7. Kleuring de gel
- Verwijder de cassette uit de gel apparatuur en breek de epoxy afdichting door nieuwsgierige van de twee plastic gel platen uit elkaar met behulp van een gel mes of een stijve plamuurmes. Haal voorzichtig de gel van de platen, en zorg dat er geen scheur de gel.
- Spoel de gel met IRG-H 2 O drie keer met zacht schudden.
- Vlekken op de gel met Invitrogen SimplyBlue SafeStain gedurende 1 uur onder zacht schudden.
- Giet de kleuroplossing endestain de gel met de IRG-H 2 O.
8. Het reinigen van de cassettes
- Gebruik een metalen spatel te schrapen of loslaten van alle epoxy op de cassettes, zodat ze opnieuw kunnen worden hergebruikt.
- Was elk van de kunststof gel platen met een mild schoonmaakmiddel en goed spoelen met kraanwater en vervolgens met gedestilleerd water.
9. Representatieve resultaten
Omdat epoxy een waterdichte afdichting (figuur 1) te vormen, de cassettes geen lekken wanneer de acrylamide oplossing wordt uitgegoten in zijn. Bovendien kan de gel cassettes eenvoudig worden geopend om de gel te halen voor vlekken en de epoxy kunnen worden afgepeld van de cassettes om de verdere hergebruik maken. Zoals getoond in figuur 2, de gel toont duidelijke scheiding van proteïne markers monster banden voor routine eiwit elektroforese.
Figuur 1. Applitoepassing van epoxy MiniGel cassettes verzegelen. een dunne laag epoxy wordt toegevoerd aan de rand van een van de cassettes vóór de montage. Om de epoxy te benadrukken, het was vals-rood gekleurd in dit beeld.
Figuur 2. Scheiding van eiwitten op een SDS-Tris-glycine gel gegoten met hergebruikt MiniGel cassettes. SDS-PAGE werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Na elektroforese werd de gel uit de cassette MiniGel, gekleurd SimplyBlue SafeStain volgens fabrikant en gefotografeerd met uitgezonden witte licht. Lane M bevat SeeBlue Plus2 pre-eiwit gekleurd normen. De molecuulgewichten van de eiwitten in laan M aangegeven aan de rechterzijde van de gel in kilodalton (kDa). De andere doorgangen laten eiwitten uit een helder gemaakt lysaat van bacteriën expressie een glutathion-S-transferase (GST)-gemerkte eiwit. De getoonde eiwitten die wassen van het glutathione kralen voor elutie van de GST-gemerkte eiwit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein gel electroforese een onmisbaar methode voor de meeste laboratoria moleculaire biologie. In de handel verkrijgbare minigels bieden een hoge mate van gemak, maar kan kostbaar zijn. Hier laten we zien hoe de MiniGel cassettes van een populair merk in de handel verkrijgbare minigels opnieuw te gebruiken. Deze methode houdt het gemak van een kant en klaar bron van gels, maar een fractie van de kosten van commercieel beschikbare minigels. Een belangrijke stap in de procedure wordt de toepassing van de juiste hoeveelheid epoxy volledig voor afdichting van de cassettes toevoegen van de gepolymeriseerde acrylamide om lekkage te voorkomen. Gebruik alleen epoxy dat geschikt is voor plastic, en laat voldoende tijd voor polymerisatie van de epoxy, zoals beschreven in de instructies van de fabrikant. Voor extra gemak kunnen meerdere cassettes worden afgesloten en opgeslagen voorafgaand aan het gieten van de gels. Bij het gieten van de gel te lossen, moet u voldoende ruimte voor het stapelen gel, meestal ongeveer 0,5 cm meer dan de hoogte van thij kam gebruikt om de putjes vormen. Tijdens de polymerisatie van het oplossend gel, houdt de gel opstaande zodanig dat de buffer verzadigde 1-butanol wordt een rechte vlakke vorm te vormen op de top van de oplossing gel. Indien het gel niet polymeriseren binnen 30 minuten kan de hoeveelheid van 10% APS en TEMED worden verhoogd. Nadat de gel is voltooid, is het belangrijk om zorgvuldig te breken epoxy afdichting om te voorkomen dat het rippen van de dunne gel. De methode die hier van het hergebruik van commerciële gel cassettes kan besparen aanzienlijke kosten in verband met frequente SDS-PAGE gebruik. Hetzelfde cassettes kunnen worden hergebruikt al jaren en we hebben geen bewijs dat herhaald gebruik van dezelfde cassette hun bruikbaarheid vermindert. Bovendien kunnen meerdere gels worden bereid en weken in een polyester barrièrefilm zak met een kleine hoeveelheid 1X stackinggel buffer die 0,1% natriumazide.
Afkortingen:
Dithiothreitol (DTT), N, N, N ', N',-tetramethylethyleendiamine (TEmed), type I pa water (IRG-H2O), ammounium persulfaat (APS), natriumdodecylsulfaat (SDS), tris (hydroxymethyl) aminomethaan (Tris-base), N, N'-methyleen-bis-acrylamide (bis -acrylamide)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs danken de Howard Hughes Medical Institute voor een UF Science for Life Award voor AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
References
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
