Summary
Notre protocole montre comment verser gels de protéines multiples à la fois par le recyclage Invitrogen cassettes NuPAGE MiniGel Novex, et des matériaux peu coûteux achetés dans un magasin de rénovation domiciliaire. Cette méthode économique et rationalisé comprend un moyen de stocker les gels à 4 ° C pendant quelques semaines. En réutilisant les cassettes de gel en plastique à partir de gels disponibles dans le commerce, les laboratoires qui exécutent des gels de protéine fréquents peuvent réduire les coûts importants et aider l'environnement.
Abstract
L'évaluation des protéines à l'aide de sodium dodécyl polyacrylamide gel de sulfate de l'électrophorèse (SDS-PAGE) l'analyse est une technique couramment utilisée par les chercheurs en biologie moléculaire et de biochimie 1-4. Pour les laboratoires qui effectuent des analyses quotidiennes de protéines, le coût de gels de polyacrylamide disponibles dans le commerce (~ $ 10/gel) peuvent être considérables au fil du temps. Pour atténuer ce coût, certains chercheurs à préparer leurs propres gels de polyacrylamide. Les méthodes traditionnelles de verser ces gels utilisent généralement l'équipement spécialisé et des plaques de gel de verre qui peuvent être coûteux et s'oppose versant gels de nombreuses et de les stocker pour une utilisation future. En outre, la manipulation de plaques de verre pendant le nettoyage ou le gel versant peut se traduire par un bris accidentel de créer un danger pour la sécurité, ce qui peut empêcher leur utilisation dans les classes de premier cycle en laboratoire. Notre protocole montre comment verser gels de protéines multiples simultanément par recyclage Invitrogen cassettes NuPAGE MiniGel Novex, et peu coûteux mariaux achetés à un magasin de rénovation domiciliaire. Cette méthode économique et rationalisé comprend un moyen de stocker les gels à 4 ° C pendant quelques semaines. En réutilisant les cassettes de gel en plastique à partir de gels disponibles dans le commerce, les laboratoires qui exécutent des gels de protéine fréquents peuvent réduire les coûts importants et aider l'environnement. En outre, cassettes de gel en plastique sont extrêmement résistants à la rupture, ce qui les rend idéal pour les salles de classe en laboratoire de premier cycle.
Protocol
1. Préparation des cassettes
- Avant et arrière Clean plaques d'un employé Invitrogen NuPAGE cassette de Novex minigel, ou d'autres cassettes minigel commerciale.
- Préparer ml environ 1-3 de plastique époxy et bien mélanger selon les instructions du fabricant.
- Appliquer la résine époxy à l'arête intérieure de la plaque avant, où les deux plaques ne viennent en contact lorsque la cassette est assemblé.
- Coulisser un morceau de papier filtre ou de carton à travers la fente inférieure de la plaque arrière lors de l'assemblage de la cassette pour éviter l'excès de résine époxy sceller l'ouverture. Retirez le papier du filtre dès que les deux plaques sont assemblées.
- Placez clips liant le long des bords pour un joint étanche, et laissez-les reposer toute la nuit cassettes pour l'époxy pour durcir complètement.
- Sceller la fente sur le bas de la plaque arrière avec du ruban électrique.
2. Coulage du gel de résolution
- Pour un flacon de 125 ml côté du bras, ajouter ce qui suit:2,25 ml de 4X Tris-Base gel de résolution tampon pH 8,70, 3,50 ml d'acrylamide 30,8% / bisacrylamide, 3,25 ml de type I eau de qualité réactif (IRG-H 2 O) pour un volume total de 9 ml.
- Dégazer la solution pendant 10 min en attachant le bras latéral du récipient à un appareil à vide, et placer un bouchon inversé sur le dessus de la fiole.
- Transférer le 9 ml de solution dégazée à un 50 ml polypropylène centrifugeuse tube jetable et ajouter 30 ul de persulfate ammounium 10% (APS) et 6 ul de N, N, N ', N',-tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et mélanger ainsi en agitant la solution pour éviter l'introduction de bulles.
- Verser immédiatement la solution dans la cassette, ce qui lui permet de fonctionner sur le côté de la cassette pour éviter toute formation de bulles entre les plaques de gel. Remplissez la cassette à environ 2 cm du bord supérieur de l'avant (plus courte) plaque.
- Doucement, ajoutez 0,5 ml de 1-butanol saturé d'un tampon 1X gel de résolution et de laisser le gel polymériser pour 1heures.
3. Verser le gel d'empilement
- Ajoutez le code suivant dans une fiole de 125 ml côté du bras: 0,75 ml de 4X Tris-Base pH du gel de tampon d'empilage 6,80, 0,40 ml d'acrylamide 30,8% / bisacrylamide, 1,85 ml de l'IRG-H 2 O pour un volume total de 3 ml.
- De-gaz de la solution pendant 10 min comme décrit dans l'étape 2.
- Alors que la solution de gel d'empilement est de dégazage, verser le 1-butanol saturé d'un tampon 1X gel de résolution à partir du haut du gel de résolution. Rincez la partie supérieure du gel résoudre une fois avec du GRI-H 2 O. Verser l 'eau et utiliser un papier absorbant ou filtre Whatman pour absorber tout le liquide restant.
- Retirer 3 ml de votre solution dégazée et ajouter 9 pi de l'APS 10% et 2 pi de TEMED et bien mélanger.
- Verser rapidement la solution dans la cassette, ce qui lui permet de fonctionner sur le côté de la cassette jusqu'à ce qu'il se trouve à proximité du bord supérieur de la plaque de gel plus courte devant.
- Insérer un peigne gel propre dans la partie supérieure de la cassette de gel,placez un clip liant sur la cassette sur le peigne pour le maintenir en place. Laissez le gel d'empilement polymériser pendant 1 heure ou toute la nuit.
4. Stockage du gel
- Lorsque le gel est complètement polymérisée, retirer les clips de liant et placer la cassette dans un sachet en plastique thermosoudable, ou un sac en plastique refermable.
- Verser 20 ml de tampon 1X gel d'empilement qui contient de l'azide de sodium à 0,1% dans la poche.
- Chauffer sceller le sachet pendant 5 secondes et assurez-vous qu'il n'ya aucune fuite dans le sac.
- Conserver le gel à 4 ° C.
5. Préparation des échantillons
- Dans un microtube à paroi mince, ajouter jusqu'à 6,5 ul de l'échantillon de protéines, 7,5 ul de 2x Novex Tris-Glycine tampon d'échantillon SDS, 1 pl de 100 mM (DTT) et dithiothréitol GRI-H 2 O (si nécessaire) pour un volume total de 15 pi.
- Mélanger l'échantillon par vortex, et brièvement centrifuger l'échantillon pour amener le contenu de la partie inférieure du tube. <p> Dénaturer l'échantillon à 70 ° C pendant 10 min.
6. Exécution du gel
- Mettre en place l'appareil à gel Novex.
- Ajouter 200 ml de tampon de migration Tris-Glycine qui contient 500 ul d'antioxydant NuPAGE à la chambre intérieure, et 300 ml de Tris-Glycine Running tampon à la chambre extérieure.
- Chargez les échantillons de protéines dénaturées (15 pi) dans les puits en utilisant un gel de chargement pointe de pipette.
- Exécutez le gel à 200 V pour 60-70 min.
7. La coloration du gel
- Retirer la cassette de l'appareil de gel et rompre le joint époxy en faisant levier les deux plaques de gel de plastique en dehors aide d'un couteau de gel ou d'une spatule rigide. Soigneusement séparer le gel des plaques, en prenant soin de ne pas déchirer le gel.
- Rincer le gel avec du GRI-H 2 O trois fois avec une légère agitation.
- Colorer le gel avec Invitrogen SimplyBlue SafeStain pendant 1 heure sous agitation douce.
- Décanter la solution de coloration et dedécolorer le gel avec du GRI-H 2 O.
8. Nettoyage des cassettes
- Utilisez une spatule en métal pour gratter ou peler tout l'époxy sur les cassettes afin qu'ils puissent être réutilisés à nouveau.
- Laver chacun des plaques de gel de plastique avec une solution de détergent doux, et rincez bien avec de l'eau du robinet puis à l'eau distillée.
9. Les résultats représentatifs
Parce époxy formera un joint étanche à l'eau, (Figure 1), les cassettes ne fuira pas quand la solution d'acrylamide est versé dans les. En outre, les cassettes de gel peut être facilement ouverte pour récupérer le gel pour la coloration, et la résine époxy peut être enlevée des cassettes pour permettre leur maintien réutilisation. Comme le montre la figure 2, le gel montre une séparation claire des marqueurs protéiques et des bandes d'échantillons appropriés pour l'électrophorèse des protéines de routine.
Figure 1. Applications d'époxy pour sceller des cassettes MiniGel. une couche mince de résine époxy est appliquée à l'arête de l'une des cassettes avant le montage. Afin de souligner l'époxy, il était faux de couleur rouge sur cette image.
Figure 2. Séparation des protéines sur un gel SDS-Tris-glycine versait à l'aide réutilisés cassettes MiniGel. SDS-PAGE a été réalisée comme décrit ci-dessus. Après électrophorèse du gel a été retiré de la cassette minigel, teinté en SimplyBlue SafeStain selon les instructions du fabricant, et photographiées à l'aide de la lumière blanche transmise. Lane M contient SeeBlue normes Plus2 protéines pré-teint. Les masses moléculaires des protéines dans piste M sont indiqués sur le côté droit du gel en kilodaltons (kDa). Les autres voies montrent protéines à partir d'un lysat clarifié à partir de bactéries exprimant une glutathion-S-transférase (GST)-protéine marquée. Les protéines indiquées sont celles lavé de la gperles lutathione avant élution de la protéine GST-étiquetés.
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Discussion
Électrophorèse sur gel des protéines est une méthode indispensable pour les laboratoires de biologie moléculaire les plus. Minigels disponibles dans le commerce de fournir un niveau élevé de confort, mais peuvent être coûteux. Ici, nous montrons comment réutiliser les cassettes MiniGel à partir d'une marque populaire de minigels disponibles dans le commerce. Cette méthode conserve la commodité d'avoir une source prête à l'emploi de gels, mais à une fraction du coût de minigels disponibles dans le commerce. Une étape clé dans l'application de cette procédure est la bonne quantité de résine époxy pour sceller complètement les cassettes avant d'ajouter l'acrylamide non polymérisée pour éviter les fuites. Utilisez seulement époxy qui est évalué pour le plastique, et laisser suffisamment de temps pour la polymérisation de la résine époxy tel que décrit dans les instructions du fabricant. Pour plus de commodité, plusieurs cassettes peuvent être scellées et stockées avant de couler les gels. Lorsque vous versez le gel de résolution, veillez à laisser assez de place pour le gel d'empilement, typiquement d'environ 0,5 cm de plus que la hauteur de til peigne utilisés pour former les puits. Lors de la polymérisation du gel de résolution, maintenir le gel de telle sorte que la position verticale du tampon-1-butanol saturé va former une droite, la surface plate pour former sur le haut de l'gel de résolution. Si le gel ne se polymérise pas moins de 30 min, le montant de 10% APS et TEMED peut être augmenté. Une fois que le gel a fini de s'exécuter, il est important de bien briser le sceau époxy pour empêcher l'extraction de la mince de gel. La méthode présentée ici de réutiliser les cassettes de gel commerciaux peuvent économiser des coûts importants associés à la fréquente utilisation de SDS-PAGE. Les mêmes cassettes peuvent être réutilisés pendant des années et nous n'avons aucune preuve que l'utilisation répétée de la même cassette réduit leur facilité d'utilisation. En outre, des gels multiples peut être préparé et conservé pendant plusieurs semaines dans un sac Film de polyester barrière contenant une petite quantité de gel d'empilement 1X tampon contenant 0,1% d'azoture de sodium.
Abréviations:
Dithiothréitol (DTT), le N, N, N ', N',-tétraméthyléthylènediamine (TEMED), le type d'eau de qualité réactif I (IRG-H2O), le persulfate ammounium (APS), dodécylsulfate de sodium (SDS), Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris-base), N, N'-méthylène-bis-acrylamide (bis -acrylamide)
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier l'Institut médical Howard Hughes pour une science UF pour l'attribution de la vie à AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
References
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
