Summary
Unser Protokoll zeigt, wie mehrere Proteingele zu einer Zeit, gießen durch Recycling Invitrogen NuPAGE Novex Minigel Kassetten und kostengünstige Materialien zu einem Baumarkt gekauft. Dieses wirtschaftliche und optimierte Verfahren umfasst einen Weg, um die Gele bei 4 ° C lagern für ein paar Wochen. Durch die Wiederverwendung der Kunststoff-Gel-Kassetten aus kommerziell erhältlichen Gelen, Labors, die häufige Proteingele laufen können erhebliche Kosten sparen und die Umwelt schonen.
Abstract
Die Auswertung der Proteine mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE-Analyse) ist eine gängige Technik der Biochemie und Molekularbiologie Forscher 1-4 verwendet. Für Laboratorien, die täglich Analyse von Proteinen führen, können die Kosten für im Handel erhältliche Polyacrylamidgelen (~ $ 10/gel) beträchtlich sein im Laufe der Zeit. Um diese Kosten zu mindern, bereiten einige Forscher ihre eigenen Polyacrylamidgelen. Traditionelle Methoden der Ausgießen dieser Gele verwenden üblicherweise spezialisierte Ausrüstung und Glas-Gel-Platten, die teuer und schließt Gießen viele Gele und speichert sie für eine zukünftige Verwendung kann. Darüber hinaus kann der Handhabung von Glasplatten bei der Reinigung oder Gel in Gießen versehentlichem Bruch schafft ein Sicherheitsrisiko darstellen, was ihren Einsatz in Labor Undergraduate-Klassen ausschließen kann zur Folge haben. Unser Protokoll zeigt, wie mehrere Proteingele gleichzeitig gießen Recycling von Invitrogen NuPAGE Novex Minigel Kassetten, und preiswert maMaterialien gekauft zu einem Baumarkt. Dieses wirtschaftliche und optimierte Verfahren umfasst einen Weg, um die Gele bei 4 ° C lagern für ein paar Wochen. Durch die Wiederverwendung der Kunststoff-Gel-Kassetten aus kommerziell erhältlichen Gelen, Labors, die häufige Proteingele laufen können erhebliche Kosten sparen und die Umwelt schonen. Darüber hinaus sind Kunststoff Gelkassetten extrem bruchfest, was sie ideal für Bachelor-Labor Klassenzimmer macht.
Protocol
1. Vorbereitung der Kassetten
- Saubere Vorder-und Rückseite eines gebrauchten Platten Invitrogen NuPAGE Novex Minigel Kassette, oder andere Geschäfte Minigel Kassette.
- Bereiten Sie etwa 1-3 ml Kunststoff Epoxy und gut mischen nach Anweisungen des Herstellers.
- Anwenden das Epoxidharz auf die Innenkante der Frontplatte, wobei die beiden Platten in Berührung kommen wird, wenn die Kassette montiert ist.
- Schieben ein Stück Filterpapier Papier oder Karton durch den Bodenschlitz der Rückplatte bei der Montage der Kassette, um überschüssiges Epoxidharz von Abdichten der Öffnung zu verhindern. Entfernen Sie das Filterpapier, sobald die beiden Platten zusammengebaut werden.
- Zeigen Binder Clips an den Rändern für einen dichten Verschluss, und lassen Sie die Kassetten sitzen über Nacht für das Epoxidharz vollständig aushärten.
- Verschließen Sie den Schlitz an der Unterseite der hinteren Platte mit Isolierband.
2. Gießen des Trenngels
- Um einen 125-ml Seitenarm Kolben, fügen Sie die folgende:2,25 ml 4X Tris-Base Trenngelpuffer pH 8,70, 3,50 ml 30,8% Acrylamid / Bisacrylamid, 3,25 ml Typ I analysenreines Wasser (IRG-H 2 O) mit einem Gesamtvolumen von 9 ml.
- De-Gas die Lösung für 10 min durch Anbringen der Seitenarm des Kolbens auf einer Vakuumvorrichtung, und Platzieren eines invertierten Anschlag auf dem oberen Ende des Kolbens.
- Übertragen Sie die 9 ml entgastem Lösung auf eine 50 ml Einweg-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen eingewogen und mit 30 ul 10% ammounium Persulfat (APS) und 6 ul N, N, N ', N',-Tetramethylethylendiamin (TEMED) und mischen auch durch Schwenken der Lösung zu vermeiden, Einführen von Bläschen.
- Gießen Sie sofort die Lösung in der Kassette, so dass es zu laufen an der Seite der Kassette, um alle Blasenbildung zwischen den Gel-Platten zu verhindern. Füllen Sie die Kassette auf ca. 2 cm vom oberen Rand des vorderen (kürzeren) Platte.
- Sanft fügen Sie 0,5 ml 1-Butanol mit 1X Trenngelpuffer gesättigt und lassen Sie das Gel für 1 polymerisierenStunde.
3. Gießen der Sammelgel
- Fügen Sie das folgende in einen 125 ml Seitenarm Flasche: 0,75 ml 4X Tris-Base Stacking-Gel-Puffer pH 6,80, 0,40 ml 30,8% Acrylamid / Bisacrylamid, 1,85 ml IRG-H 2 O mit einem Gesamtvolumen von 3 ml.
- De-Gas die Lösung für 10 min, wie in Schritt 2 beschrieben.
- Während die Stacking-Gel-Lösung Entgasung, giesst die 1-Butanol mit 1X Trenngelpuffer von der Oberseite des Trenngels gesättigt. Spülen Sie den oberen Rand des Trenngels einmal mit IRG-H 2 O. Gießen Sie das Wasser ab und verwenden Sie eine saugfähige oder Whatman-Filterpapier, um restliche Flüssigkeit zu absorbieren.
- Nehmen Sie 3 ml Ihren entgaste Lösung und fügen 9 ul von 10% APS und 2 ul TEMED und gut mischen.
- Schnell geben die Lösung in der Kassette, so dass er mittig entlang der Seite der Kassette, bis sie nahe dem oberen Rand der kürzeren vorderen Gelplatte ist.
- Legen Sie eine saubere Gel Kamm in der Spitze des Gelkassette,Stellen Sie einen Binder Clip auf der Kassette über den Kamm zu halten Sie es fest. Lassen Sie die Stacking-Gel für 1 Stunde bis über Nacht zu polymerisieren.
4. Speichern Sie das Gel
- Wenn das Gel vollständig polymerisiert, entfernen Sie die Binder Clips und legen Sie die Kassette in einer heißsiegelfähigen Plastikbeutel oder eine wieder verschließbare Plastiktüte.
- Gießen 20 ml 1X Stacking-Gel Puffer, 0,1% Natriumazid in den Beutel enthält.
- Heißzusiegeln den Beutel für 5 Sekunden und stellen Sie sicher, es gibt keine Lecks in der Tasche.
- Bewahren Sie das Gel bei 4 ° C
5. Die Vorbereitung der Proben
- In einem dünnwandigen Mikrozentrifugenröhrchen, summieren sich auf 6,5 ul der Probe Protein, 7,5 ul 2x Novex Tris-Glycin-SDS-Probenpuffer, 1 ul 100 mM Dithiothreitol (DTT) und IRG-H 2 O (falls erforderlich) für ein Gesamtvolumen von 15 ul.
- Mischen Sie die Probe durch Vortexen, und kurz zentrifugieren Sie die Probe auf Inhalte auf dem Boden des Röhrchens zu bringen. <li> denaturieren die Probe bei 70 ° C für 10 min.
6. Das Ausführen des Gels
- Richten Sie das Novex Gel-Apparatur.
- Zugabe von 200 ml Tris-Glycin-Laufpuffer, die 500 ul NuPAGE Antioxidationsmittel in die innere Kammer, und 300 ml Tris-Glycin-Laufpuffer in die äußere Kammer enthält.
- Legen Sie die denaturierten Proteinproben (15 ul) in die Vertiefungen mit einem Gelbeladung Pipettenspitze.
- Die Elektrophorese bei 200 V für 60-70 min.
7. Färbung des Gels
- Nehmen Sie die Kassette aus dem Gel Apparate und brechen die Epoxiddichtung durch Aufhebeln der beiden Kunststoff-Gel-Platten auseinander mit einem Messer oder einem Gel steif Spachtel. Trennen Sie vorsichtig das Gel von den Platten, darauf achtend, nicht reißen das Gel.
- Spülen des Gels mit IRG-H 2 O dreimal mit leichtem Schütteln.
- Färben des Gels mit Invitrogen SimplyBlue SafeStain für 1 Stunde unter leichtem Rühren.
- Abgießen und FärbelösungEntfärben des Gels mit IRG-H 2 O.
8. Die Reinigung der Kassetten
- Verwenden Sie einen Spachtel aus Metall zu kratzen oder ablösen all dem Epoxidharz auf den Kassetten, so dass sie wieder verwendet werden können.
- Waschen Sie jede der Kunststoff-Gel-Platten mit einer milden Reinigungslösung, und spülen Sie gut mit Leitungswasser mit destilliertem Wasser spülen.
9. Repräsentative Ergebnisse
Da Epoxy eine wasserdichte Abdichtung (1) bilden wird, werden die Kassetten nicht lecken, wenn das Acrylamid-Lösung in sie gegossen wird. Darüber hinaus können die Gelkassetten leicht geöffnet werden, um das Gel für die Färbung abzurufen, und das Epoxidharz kann aus der Kassetten abgezogen werden, um ihre weitere Wiederverwendung zu ermöglichen. Wie in 2 gezeigt ist, zeigt das Gel klare Trennung von Protein-Marker und Probe Bands für den routinemäßigen-Elektrophorese.
Abbildung 1. AppliKationen von Epoxy zu Minigel Kassetten abzudichten. Eine dünne Schicht von Epoxid wird an den Rand einer der Kassetten vor der Montage aufgebracht. Um das Epoxid zu markieren, war es falsch-rot gefärbt in diesem Bild.
Abbildung 2. Trennung von Proteinen auf einem SDS-Tris-Glycin-Gel gegossen und mit wieder verwendet Minigel Kassetten. SDS-PAGE durchgeführt wurde, wie oben beschrieben. Nach der Elektrophorese wurde das Gel aus der Minigel Kassette, in SimplyBlue SafeStain gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt entfernt und fotografiert mit weißem Licht übertragen. Spur M enthält SeeBlue Plus2 Pre-gefärbten Protein-Standards. Die Molekulargewichte der Proteine in Spur M sind auf der rechten Seite des Gels in Kilodalton (kDa) angegeben. Die anderen Spuren für Proteine aus einem geklärten Lysat von Bakterien Expression eines Glutathion-S-Transferase (GST)-markierte Protein. Die Proteine sind diejenigen vom g gewaschenlutathione Kügelchen vor der Elution des GST-markierten Proteins.
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Discussion
Protein-Gel-Elektrophorese ist eine unverzichtbare Methode für die meisten molekularbiologischen Laboratorien. Im Handel erhältliche Minigelen bieten ein hohes Maß an Komfort, sondern kann teuer werden. Hier zeigen wir, wie man die Wiederverwendung der Minigel Kassetten aus einer populären Marke im Handel erhältliche Minigelen. Dieses Verfahren hält die Einfachheit eines vorgefertigten Quelle von Gelen, aber nur einen Bruchteil der Kosten für im Handel erhältliche Minigelen. Ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren wird die Anwendung die richtige Menge an Epoxid vollständig zu versiegeln Sie die Kassetten vor der Zugabe des polymerisierten Acrylamid, um ein Auslaufen zu verhindern. Verwenden Sie nur die für Epoxid-Kunststoff ausgelegt ist, und planen Sie genügend Zeit für die Polymerisation des Epoxidharzes wie in der Anleitung des Herstellers beschrieben. Für zusätzlichen Komfort können mehrere Kassetten versiegelt und aufbewahrt werden vor dem Gießen der Gele. Beim Gießen des Trenngels, achten Sie darauf, genug Platz für die Stacking-Gel zu verlassen, in der Regel ca. 0,5 cm mehr als die Höhe der tKamm er verwendet, um die Brunnen zu bilden. Während der Polymerisation des Trenngels, zu halten das Gel aufrecht, so dass der Puffer-gesättigtem 1-Butanol wird eine gerade, flache Oberfläche zu bilden, um auf der Oberseite des Trenngels bilden. Wenn das Gel nicht innerhalb von 30 min polymerisiert, kann die Menge des 10% igen APS und TEMED erhöht werden. Sobald das Gel ausgeführt wurde, ist es wichtig, sorgfältig zu brechen Epoxiddichtung um zu verhindern, riss das dünne Gel. Die Methode berichtet hier von der Wiederverwendung von kommerziellen Gelkassetten können erhebliche Kosten mit häufigen SDS-PAGE-Nutzung verbundenen speichern. Die gleichen Kassetten können über Jahre wieder verwendet werden und wir haben keine Beweise dafür, dass die wiederholte Verwendung des gleichen Kassette ihre Nutzbarkeit reduziert. Darüber hinaus können mehrere Gele hergestellt und für Wochen in einem Polyester Sperrfilm Beutel mit einer kleinen Menge von 1X Stacking-Gel-Puffer mit 0,1% Natriumazid gelagert werden.
Abkürzungen:
Dithiothreitol (DTT), N, N, N ', N',-Tetramethylethylendiamin (TEMED), Typ I gereinigtem Wasser (IRG-H2O), ammounium Persulfat (APS), Natriumdodecylsulfat (SDS), Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris-Base), N, N'-Methylen-bis-acrylamid (BIS -acrylamid)
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren danken dem Howard Hughes Medical Institute für eine UF Science for Life Award an AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
References
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
