Summary
हमारे प्रोटोकॉल को दर्शाता है कैसे रीसाइक्लिंग Invitrogen Nupage NOVEX minigel कैसेट, और कम खर्चीली सामग्री एक घर सुधार की दुकान में खरीदा द्वारा एक समय में कई प्रोटीन जैल डाल. यह किफायती और सुव्यवस्थित विधि 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कुछ हफ्तों के लिए जैल की दुकान भी शामिल है. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जैल, प्रयोगशालाओं कि अक्सर प्रोटीन जैल चलाने से प्लास्टिक जेल कैसेट फिर से का उपयोग करके महत्वपूर्ण लागत बचाने के लिए और पर्यावरण की मदद कर सकते हैं.
Abstract
प्रोटीन का मूल्यांकन dodecyl सोडियम सल्फेट polyacrylamide जेल विश्लेषण वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पेज) का उपयोग एक आम तकनीक जैव रसायन और आणविक जीव विज्ञान 1-4 शोधकर्ताओं द्वारा प्रयोग किया जाता है. प्रयोगशालाओं है कि प्रोटीन की दैनिक विश्लेषण करने के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध polyacrylamide जैल (~ 10/gel डॉलर) की लागत पर काफी समय हो सकता है. इस लागत को कम करने के लिए, कुछ शोधकर्ताओं ने अपने स्वयं के polyacrylamide जैल तैयार करते हैं. इन जैल घनघोर के पारंपरिक तरीकों आमतौर पर विशेष उपकरणों और गिलास जेल प्लेटें कि महंगा हो सकता है और कई जैल डालने के लिये और उन्हें भविष्य के उपयोग के लिए भंडारण रोकना कर सकते हैं का उपयोग. इसके अलावा, सफाई या जेल में डालने का कार्य के दौरान गिलास प्लेट की हैंडलिंग आकस्मिक टूटना एक सुरक्षा के लिए खतरा है, जो स्नातक प्रयोगशाला कक्षाओं में उनके उपयोग छीन कर सकते हैं बनाने में परिणाम कर सकते हैं. हमारा प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे कई प्रोटीन जैल डाल करने के लिए एक साथ रीसाइक्लिंग Invitrogen Nupage NOVEX minigel कैसेट के द्वारा, और सस्ती माterials एक घर सुधार की दुकान पर खरीदा है. यह किफायती और सुव्यवस्थित विधि 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कुछ हफ्तों के लिए जैल की दुकान भी शामिल है. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जैल, प्रयोगशालाओं कि अक्सर प्रोटीन जैल चलाने से प्लास्टिक जेल कैसेट फिर से का उपयोग करके महत्वपूर्ण लागत बचाने के लिए और पर्यावरण की मदद कर सकते हैं. इसके अलावा, प्लास्टिक जेल कैसेट अत्यंत टूटना है, जो उन्हें स्नातक प्रयोगशाला की कक्षाओं के लिए आदर्श बनाता है के लिए प्रतिरोधी रहे हैं.
Protocol
1. कैसेट की तैयारी
- साफ़ सामने और एक प्रयोग किया Invitrogen Nupage NOVEX minigel कैसेट, या अन्य वाणिज्यिक minigel के कैसेट की प्लेटें वापस.
- प्लास्टिक epoxy के लगभग 1-3 मिलीग्राम तैयार और निर्माता के निर्देशों के अनुसार मिश्रण अच्छी तरह से.
- सामने थाली, जहां दो प्लेटों के संपर्क में आते हैं जब कैसेट इकट्ठा किया है के अंदर किनारे करने के लिए epoxy लागू करें.
- वापस प्लेट के नीचे भट्ठा के माध्यम से फिल्टर पेपर या गत्ते का एक टुकड़ा जब कैसेट कोडांतरण सील खोलने से अधिक epoxy के रोकने के स्लाइड. फिल्टर पेपर के रूप में जल्द ही दो प्लेटों के रूप में इकट्ठा कर रहे हैं निकालें.
- किनारों के साथ एक तंग सील के लिए बांधने की मशीन क्लिप रखें, और कैसेट epoxy के लिए पूरी तरह से इलाज के लिए रात भर बैठना.
- बिजली के टेप के साथ वापस थाली के तल पर भट्ठा सील.
2. हल जेल गिरने
- एक 125 मिलीलीटर की ओर हाथ फ्लास्क, निम्नलिखित जोड़ें:4X Tris बेस समाधान जेल बफर 8.70 पीएच, 30.8% acrylamide / bisacrylamide 3.50 मिलीग्राम, का प्रकार 3.25 मिलीग्राम की 2.25 मिलीग्राम 9 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए मैं अभिकर्मक ग्रेड पानी (IRG - एच 2 हे).
- De - गैस एक निर्वात उपकरण के लिए कुप्पी की ओर हाथ संलग्न है, और कुप्पी के शीर्ष पर एक औंधा डाट रखने से 10 मिनट के लिए समाधान.
- एक 50 मिलीलीटर डिस्पोजेबल polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब de-मार डाला समाधान के 9 मिलीग्राम स्थानांतरण और के 30 μl 10% ammounium के persulfate (ए पी एस) और एन के μl 6, एन, एन, एन, tetramethylethylenediamine (TEMED) और मिश्रण जोड़ें समाधान घूमता बुलबुले शुरू करने से बचने के द्वारा अच्छी तरह से.
- कैसेट में तुरंत समाधान डालना, यह कैसेट की ओर जेल प्लेटों के बीच बनाने से किसी भी बुलबुले को रोकने चलाने के लिए अनुमति देता है. कैसेट सामने थाली (कम) के शीर्ष किनारे से लगभग 2 सेमी करने के लिए भरें.
- धीरे 1-butanol 0.5 मिलीग्राम 1X हल जेल बफर के साथ संतृप्त जोड़ सकते हैं और जेल के लिए 1 भाजन करनाघंटा.
3. स्टैकिंग जेल गिरने
- 4X Tris बेस स्टेकिंग जेल बफर 6.80 पीएच, 30.8% acrylamide / bisacrylamide 0.40 मिलीग्राम, 3 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए 1.85 IRG एच 2 हे मिलीलीटर की 0.75 मिलीग्राम: एक 125 मिलीलीटर की ओर हाथ कुप्पी के लिए निम्नलिखित जोड़ें.
- 10 मिनट के रूप में चरण 2 में वर्णित समाधान के लिए डी - गैस.
- जबकि स्टैकिंग जेल समाधान degassing है, 1-1X हल जेल के ऊपर से हल जेल बफर के साथ संतृप्त butanol डालना. IRG एच 2 ओ के साथ हल जेल के ऊपर एक बार कुल्ला पानी डालो और एक शराबी या वाटमान फिल्टर पेपर का उपयोग करने के लिए किसी भी शेष तरल अवशोषित.
- 3 अपने degassed समाधान के मिलीलीटर निकालें और 10% के ए पी एस और TEMED की 2 μl 9 μl जोड़ने और मिश्रण अच्छी तरह से.
- जल्दी से कैसेट में समाधान डालना, यह कैसेट के पक्ष को चलाने के लिए जब तक यह कम सामने जेल थाली के शीर्ष किनारे के पास है की अनुमति.
- जेल कैसेट के शीर्ष में एक साफ जेल कंघी डालें,यह जगह में पकड़ कंघी से अधिक कैसेट पर एक बांधने की मशीन क्लिप जगह. स्टैकिंग जेल रात भर के लिए 1 घंटे के लिए भाजन करना.
4. जेल भंडारण
- जब जेल polymerized पूरी तरह से है, बांधने की मशीन क्लिप को हटाने और एक गर्मी sealable प्लास्टिक की थैली में कैसेट, या फिर से sealable प्लास्टिक बैग जगह है.
- 1X स्टैकिंग जेल बफर है कि 0.1% की थैली में सोडियम azide के 20 मिलीलीटर डालो.
- गर्मी 5 सेकंड के लिए पाउच सील बैग में कोई लीक कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर जेल स्टोर
5. नमूने की तैयारी
- एक पतली दीवारों microcentrifuge के ट्यूब में, प्रोटीन नमूना की 6.5 μl, 7.5 2x NOVEX एसडीएस Tris-Glycine नमूना बफर, 100 मिमी (डीटीटी) dithiothreitol और IRG - एच 2 हे 1 μl (यदि आवश्यक) के लिए एक μl 15 μl की कुल मात्रा.
- मिश्रण vortexing द्वारा नमूना, और संक्षिप्त नमूना अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे करने के लिए सामग्री लाने के. <ली denature> 70 नमूना ° C 10 मिनट के लिए.
6. जेल रनिंग
- NOVEX जेल उपकरण सेट.
- Tris-Glycine रनिंग बफर के 200 मिलीलीटर है कि भीतरी कक्ष में Nupage एंटीऑक्सीडेंट के 500 μl, और Tris-Glycine बाहरी कक्ष बफर चल रहा है की 300 मिलीलीटर जोड़ें.
- एक जेल लोड हो रहा है विंदुक टिप का उपयोग कुओं में लोड विकृत प्रोटीन के नमूने (15 μl).
- 60-70 मिनट के लिए 200 वी पर जेल चलाएँ.
7. जेल धुंधला हो जाना
- जेल तंत्र से कैसेट निकालें और दो प्लास्टिक जेल के अलावा एक जेल चाकू या एक कड़ी पोटीन चाकू का उपयोग कर प्लेट खोजी epoxy सील तोड़ने. प्लेटों से जेल ध्यान से अलग है, देखभाल जेल आंसू नहीं.
- IRG एच के साथ जेल 2 हे कोमल आंदोलन के साथ तीन बार कुल्ला.
- कोमल आंदोलन के साथ 1 घंटा Invitrogen SimplyBlue SafeStain के लिए साथ जेल दाग.
- धुंधला समाधान डालो औरIRG एच 2 ओ के साथ जेल destain
8. कैसेट सफाई
- परिमार्जन या छील कैसेट पर सभी epoxy के बंद ताकि वे फिर से reused किया जा सकता है एक धातु रंग का उपयोग करें.
- एक हल्के साबुन समाधान के साथ प्लास्टिक जेल प्लेटों के प्रत्येक धो, और नल का पानी आसुत जल के साथ अच्छी तरह कुल्ला.
9. प्रतिनिधि परिणाम
क्योंकि epoxy मुहर पानी तंग (चित्र 1) फार्म, कैसेट रिसाव नहीं होगा जब acrylamide समाधान में उन्हें डाल दिया है. इसके अलावा, जेल कैसेट आसानी से धुंधला के लिए जेल पुनः प्राप्त खोला जा सकता है, और epoxy कैसेट से खुली उनके निरंतर फिर से उपयोग करने की अनुमति कर सकते हैं. चित्रा 2 में दिखाया गया है, जेल प्रोटीन मार्करों और नमूना दिनचर्या प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन के लिए उपयुक्त बैंड स्पष्ट जुदाई से पता चलता है.
आकृति 1. Appliepoxy के minigel कैसेट सील की कटियन. epoxy की एक पतली परत विधानसभा के लिए पहले एक कैसेट की बढ़त के लिए लागू किया जाता है. Epoxy को उजागर करने के लिए, यह इस छवि में झूठी रंग लाल था.
चित्रा 2. एसडीएस Tris - ग्लाइसिन जेल पर प्रोटीन की जुदाई फिर से इस्तेमाल किया minigel कैसेट का उपयोग कर डाला एसडीएस पृष्ठ के रूप में ऊपर वर्णित किया गया था. निम्नलिखित वैद्युतकणसंचलन जेल minigel कैसेट, निर्माता के निर्देशों के अनुसार SimplyBlue SafeStain में दाग से हटा दिया गया था, और संचरित सफेद प्रकाश का उपयोग कर फोटो खिंचवाने. लेन एम SeeBlue Plus2 पूर्व दाग प्रोटीन मानकों के शामिल हैं. एम लेन में प्रोटीन की आणविक भार (केडीए) kiloDaltons में जेल की दाईं ओर संकेत कर रहे हैं. अन्य गलियों glutathione-S-transferase प्रोटीन (जीएसटी) टैग व्यक्त बैक्टीरिया से एक को मंजूरी दे दी lysate से प्रोटीन दिखा. दिखाया प्रोटीन जी से धोया उन हैंlutathione प्रोटीन की क्षालन जीएसटी टैग से पहले मोती.
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Discussion
प्रोटीन जेल वैद्युतकणसंचलन सबसे आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए एक अनिवार्य विधि है. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध minigels सुविधा के एक उच्च स्तर प्रदान करते हैं, लेकिन महंगा हो सकता है. यहां हम बताते हैं कैसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध minigels का एक लोकप्रिय ब्रांड से minigel कैसेट फिर से उपयोग. इस विधि तैयार किया जैल का एक स्रोत होने की सुविधा को बरकरार रखे हुए है, लेकिन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध minigels की लागत का एक अंश पर. इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम epoxy की सही राशि के लिए पूरी तरह से कैसेट unpolymerized acrylamide जोड़ने के रिसाव को रोकने के लिए पहले सील लागू है. केवल epoxy कि प्लास्टिक के लिए दर्जा दिया है का उपयोग करें, और epoxy के polymerization के लिए पर्याप्त समय की अनुमति के रूप में निर्माता के निर्देशों में वर्णित है. जोड़ा सुविधा के लिए, कई कैसेट और सील किया जा सकता है पूर्व जैल डालने का कार्य करने के लिए संग्रहीत. जब हल जेल डालने के लिये, stacking के जेल के लिए पर्याप्त जगह छोड़ने के लिए सुनिश्चित हो, आमतौर पर के बारे में 0.5 सेमी टी की ऊंचाई से अधिकवह कंघी करने के लिए कुओं के रूप में इस्तेमाल किया. हल जेल के polymerization के दौरान जेल ईमानदार जैसे कि बफर संतृप्त 1 butanol एक सीधी, सपाट सतह के रूप में हल जेल के शीर्ष पर फार्म रखने के लिए. अगर 30 मिनट के भीतर जेल भाजन करना नहीं करता है, 10% ए पी एस और TEMED की राशि में वृद्धि हुई किया जा सकता है. एक बार जेल चल रहा है खत्म हो गया है, यह महत्वपूर्ण है ध्यान से epoxy सील तोड़ने के लिए जेल पतली तेजस्वी रोकने. विधि का उपयोग वाणिज्यिक जेल कैसेट महत्वपूर्ण अक्सर प्रयोग एसडीएस पृष्ठ के साथ जुड़े लागत बचा सकता है की यहाँ की सूचना दी. वही कैसेट साल के लिए reused किया जा सकता है और हम कोई सबूत नहीं है कि एक ही कैसेट की दोहराया का उपयोग उनके प्रयोज्य कम कर देता है. इसके अलावा, कई जैल और तैयार किया जा सकता है एक पॉलिएस्टर बाधा फिल्म 1X स्टैकिंग जेल 0.1% सोडियम azide युक्त बफर की एक छोटी राशि युक्त बैग में सप्ताह के लिए संग्रहीत.
लघुरूप:
Dithiothreitol (डीटीटी), एन, एन, एन, एन '(tetramethylethylenediamine टीEMED), मैं अभिकर्मक ग्रेड (IRG H2O) पानी, ammounium persulfate (ए पी एस), dodecyl सोडियम सल्फेट (एसडीएस), Tris (hydroxymethyl) (Tris आधार) aminomethane, एन लिए, N'methylene बीआईएस - acrylamide (बीआईएस लिखें - acrylamide)
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों मुख्यालय हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट जीवन पुरस्कार के लिए एक UF विज्ञान के लिए धन्यवाद
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
References
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
