Summary
Il nostro protocollo dimostra come versare gel proteici più in un momento di riciclaggio Invitrogen Nupage Novex minigel cassette e materiali a basso costo acquistati in un negozio di miglioramento domestico. Questo metodo economico e razionale include un modo per memorizzare i gel a 4 ° C per alcune settimane. Per riutilizzare le cassette di plastica da gel gel disponibili in commercio, laboratori che eseguono gel proteici frequenti possono notevoli risparmi sui costi e aiutare l'ambiente.
Abstract
La valutazione delle proteine che utilizzano sodio dodecil solfato di elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) L'analisi è una tecnica comunemente usata dai ricercatori Biochimica e Biologia Molecolare 1-4. Per i laboratori che eseguono analisi giornaliere di proteine, il costo di gel di poliacrilammide disponibili in commercio (~ $ 10/gel) può essere considerevole nel tempo. Per ridurre questo costo, alcuni ricercatori preparano i loro gel di poliacrilammide propri. I metodi tradizionali di riversare questi gel tipicamente utilizzano attrezzature specializzate e delle lastre di gel di vetro che possono essere costosi e preclude colata gel molti e la loro memorizzazione per un uso futuro. Inoltre, la movimentazione delle lastre di vetro durante la pulizia o gel versando può portare a rotture accidentali creando un pericolo per la sicurezza, che potrebbe precludere il loro uso in laboratorio le classi di laurea. Il nostro protocollo dimostra come versare gel proteici contemporaneamente dal riciclaggio Invitrogen Nupage Novex cassette minigel, e poco costoso materiali acquistato in un negozio di miglioramento domestico. Questo metodo economico e razionale include un modo per memorizzare i gel a 4 ° C per alcune settimane. Per riutilizzare le cassette di plastica da gel gel disponibili in commercio, laboratori che eseguono gel proteici frequenti possono notevoli risparmi sui costi e aiutare l'ambiente. Inoltre, le cassette di plastica gel sono estremamente resistenti alla rottura, che li rende ideali per le aule di laboratorio di laurea.
Protocol
1. Preparare le cassette
- Anteriore e posteriore Clean piatti di un usato cassette Invitrogen Nupage Novex minigel, o altre cassette minigel commerciale.
- Preparare circa 1-3 ml di resina epossidica di plastica e mescolare bene secondo le istruzioni del produttore.
- Applicare la resina epossidica al bordo interno della piastra frontale, dove le due piastre a contatto quando la cassetta viene assemblato.
- Inserire un pezzo di carta da filtro o cartone attraverso la fessura inferiore della piastra posteriore durante il montaggio della cassetta per impedire resina in eccesso di sigillare l'apertura. Rimuovere la carta da filtro non appena le due piastre sono assemblati.
- Posizionare le clip leganti lungo i bordi per una tenuta perfetta, e lasciare che le cassette sedersi durante la notte per la resina epossidica per curare completamente.
- Sigillare la fessura sul fondo della piastra posteriore con nastro isolante.
2. Versare il gel risolvere
- Per un pallone da 125 ml braccio laterale, aggiungere il seguente:2,25 ml di Tris-4X Base Resolving gel tampone pH 8,70, 3,50 ml di 30,8% acrilammide / bisacrilammide, 3,25 ml di Tipo I acqua distillata (IRG-H 2 O) per un volume totale di 9 ml.
- De-gas la soluzione per 10 minuti collegando il braccio laterale del pallone ad un apparato per il vuoto, e ponendo un tappo capovolta sulla parte superiore del pallone.
- Trasferire il 9 ml di degassati soluzione ad un tubo 50 di polipropilene monouso centrifuga ml e aggiungere 30 ul di persolfato ammounium 10% (APS) e 6 pl di N, N, N ', N',-tetrametiletilendiammina (TEMED) e miscelare ben agitando la soluzione per evitare di introdurre bolle.
- Immediatamente versare la soluzione nel cassetto, permettendo l'esecuzione lungo il lato della cassetta per evitare la formazione di bolle tra le lastre di gel. Riempire la cassetta di circa 2 cm dal bordo superiore della parte anteriore (più corta) piastra.
- Delicatamente aggiungere 0,5 ml di 1-butanolo saturato con 1X tampone di gel risoluzione e lasciare che il gel polimerizzare per 1ore.
3. Versare il gel di impilamento
- Aggiungere quanto segue in un pallone da 125 ml braccio laterale: 0,75 ml di 4X Tris-Base pH gel impilabile tampone 6,80, 0,40 ml del 30,8% di acrilammide / bisacrilammide, 1,85 ml di IRG-H 2 O per un volume totale di 3 ml.
- De-gas la soluzione per 10 min come descritto nel passaggio 2.
- Mentre la soluzione di gel di impilamento è degassaggio, travasare l'1-butanolo saturato con 1X tampone di gel risolutivo dalla parte superiore del gel risolvere. Lavare la parte superiore del gel risolvere una volta con IRG-H 2 O. Versare l'acqua e usare un filtro di carta assorbente o Whatman per assorbire eventuali residui di liquido.
- Rimuovere le 3 ml di soluzione degasata e aggiungere 9 microlitri di 10% APS e 2 pl di TEMED e mescolare bene.
- Rapidamente versare la soluzione nella cassetta, consentendogli di scorrere lungo la facciata del nastro fino a che è vicino al bordo superiore della piastra anteriore più corta di gel.
- Inserire un pettine pulito gel nella parte superiore della cassetta gel,posizionare una clip legante sulla cassetta sopra il pettine per mantenerlo in posizione. Lasciate che il gel di impilamento polimerizzare per 1 ora a tutta la notte.
4. Conservazione del gel
- Quando il gel è completamente polimerizzato, rimuovere le clip legante e collocare la cassetta in un termosaldabile sacchetto di plastica, o un richiudibile sacchetto di plastica.
- Versare 20 ml di tampone 1X stacking gel che contiene sodio azide allo 0,1% nel sacchetto.
- Si chiude la sacca per 5 secondi e assicurarsi che non vi siano perdite in borsa.
- Conservare il gel a 4 ° C.
5. Preparazione dei Campioni
- In un sottile tubo da microcentrifuga, aggiungere fino a 6,5 pl di campione proteico, 7,5 pl di 2x Novex Tris-glicina tampone campione SDS, 1 pl di mM ditiotreitolo 100 (DTT) e IRG-H 2 O (se necessario) per volume totale di 15 pl.
- Mescolare il campione vortex, e brevemente centrifugare il campione per consentire al contenuto di fondo della provetta. <li> denaturare il campione a 70 ° C per 10 min.
6. Esecuzione del gel
- Sistemare il dispositivo di Novex gel.
- Aggiungere 200 ml di Tris-glicina tampone di corsa che contiene 500 pl di antiossidante Nupage alla camera interna, e 300 ml di Tris-glicina Il tampone di corsa alla camera esterna.
- Caricare i campioni di proteine denaturate (15 pl) nei pozzetti di carico utilizzando un gel punta della pipetta.
- Eseguire il gel a 200 V per 60-70 min.
7. Colorazione del gel
- Rimuovere la cassetta dall'apparecchio gel e rompere il sigillo epossidica facendo leva le due lastre di gel di plastica distanza utilizzando un coltello gel o una spatola rigida. Separare con attenzione il gel dalle piastre, avendo cura di non strappare il gel.
- Sciacquare il gel con IRG-H 2 O tre volte con leggera agitazione.
- Colorare il gel con Invitrogen SimplyBlue SafeStain per 1 ora con leggera agitazione.
- Versare la soluzione colorante eDecolorare il gel con IRG-H 2 O.
8. Pulizia delle cassette
- Utilizzare una spatola metallica per raschiare o staccare tutta la resina epossidica sulle cassette in modo che possano essere riutilizzati nuovamente.
- Lavare ciascuna delle lastre di gel di plastica con una soluzione detergente delicato, e sciacquare bene con acqua corrente e poi con acqua distillata.
9. Risultati rappresentativi
Poiché epossidica formare una tenuta stagna, (figura 1), le cassette non fuoriuscirà quando la soluzione viene versata in acrilammide loro. Inoltre, le cassette gel possono essere facilmente aperta per recuperare il gel per la colorazione, e la resina epossidica può venire distaccato delle cassette per consentire loro continuo riutilizzo. Come mostrato in figura 2, il gel mostra netta separazione dei marcatori proteici e nastri di esempio adatti per elettroforesi proteine routine.
Figura 1. Applizione di resina epossidica per sigillare cassette minigel. Un sottile strato di resina epossidica viene applicato sul bordo di una delle cassette prima dell'assemblaggio. Per evidenziare la resina epossidica, che era falso-colore rosso in questa immagine.
Figura 2. Separazione delle proteine su una SDS-Tris-glicina gel versato utilizzando riutilizzati cassette minigel. SDS-PAGE è stata eseguita come descritto sopra. In seguito il gel elettroforesi è stato rimosso dalla cassetta minigel, macchiato in SimplyBlue SafeStain secondo le istruzioni del produttore, e fotografato trasmesse mediante sistemi di luce bianca. Corsia M contiene SeeBlue Plus2 pre-colorati standard di proteine. I pesi molecolari delle proteine in corsia M sono indicate sul lato destro del gel in chilodalton (kDa). Le altre corsie mostrano proteine da un lisato eliminato da batteri esprimenti un glutatione-S-transferasi (GST)-tag proteina. Le proteine indicati sono quelli lavati dal gperline lutathione prima dell'eluizione della proteina GST-tag.
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Discussion
Gel elettroforesi delle proteine è un metodo indispensabile per la maggior parte laboratori di biologia molecolare. Minigels commercialmente disponibili forniscono un elevato livello di comfort, ma può essere costoso. Qui vi mostriamo come riutilizzare le cassette minigel da una popolare marca di minigels disponibili in commercio. Questo metodo mantiene la comodità di avere una pronta fonte di gel, ma ad una frazione del costo di minigels disponibili in commercio. Un passaggio chiave in questo procedimento sta applicando la giusta quantità di resina epossidica per sigillare completamente le cassette prima di aggiungere il acrilammide polimerizzato per evitare perdite. Utilizzare epossidica solo che viene valutato per la plastica, e tempo sufficiente per la polimerizzazione della resina epossidica come descritto nelle istruzioni del produttore. Per una maggiore comodità, cassette multiple possono essere sigillati e conservati prima di versare i gel. Quando si versa il gel risolvere, assicurarsi di lasciare abbastanza spazio per il gel di impilamento, tipicamente di circa 0,5 cm in più rispetto all'altezza del tegli pettine utilizzati per formare i pozzetti. Durante la polimerizzazione del gel risolvere, mantenere il gel montante tale che il buffer-1-butanolo saturo formerà una retta, superficie piana per formare sulla superficie del gel risolvere. Se il gel non polimerizza entro 30 minuti, la quantità del 10% APS e TEMED può essere aumentata. Una volta che il gel ha terminato l'esecuzione, è importante per rompere il sigillo attentamente epossidica per impedire lo strappo del gel sottile. Il metodo qui riportato di riutilizzare le cassette gel commerciali possono risparmiare sui costi significativi associati con frequenti SDS-PAGE uso. Le cassette stesse può essere riutilizzata per anni e non abbiamo alcuna prova che l'uso ripetuto della stessa cassetta riduce la loro usabilità. Inoltre, gel multipli possono essere preparate e conservate per settimane in un sacchetto pellicola di poliestere barriera contenente una piccola quantità di 1X tampone di gel di impilamento contenente 0,1% di sodio azide.
Abbreviazioni:
Ditiotreitolo (DTT), N, N, N ', N',-tetrametiletilendiammina (TEmed), di tipo I di acqua distillata (IRG-H2O), ammounium persolfato (APS), sodio dodecil solfato (SDS), Tris (idrossimetil) amminometano (Tris-base), N, N'-metilene-bis-acrilammide (bis -acrilammide)
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano l'Howard Hughes Medical Institute per una scienza UF per l'aggiudicazione Vita AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
References
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
