Summary
Nuestro protocolo se muestra cómo se vierta geles múltiples proteínas a la vez de reciclaje de Invitrogen casetes NuPAGE Novex minigel, y materiales baratos comprados en una tienda de mejoras para el hogar. Este método económico y eficiente incluye una forma de almacenar los geles a 4 ° C durante unas pocas semanas. Al reutilizar los cartuchos de gel de plástico de los geles disponibles en el mercado, los laboratorios que se ejecutan frecuentes geles de proteínas puede ahorrar costos significativos y ayudar al medio ambiente.
Abstract
La evaluación de las proteínas utilizando poliacrilamida dodecilsulfato de sodio electroforesis en gel (SDS-PAGE) análisis es una técnica común utilizada por los investigadores bioquímica y biología molecular 1-4. Para los laboratorios que realizan análisis diarios de proteínas, el costo de geles de poliacrilamida comercialmente disponibles (~ $ 10/gel) puede ser considerable en el tiempo. Para mitigar este costo, algunos investigadores preparan sus propios geles de poliacrilamida. Los métodos tradicionales de verter estos geles suelen utilizar equipo especializado y placas de vidrio de gel que puede ser costoso y evitar verter muchos geles y su almacenamiento para uso futuro. Por otra parte, la manipulación de placas de vidrio durante la limpieza o el gel vertiendo puede resultar en la rotura accidental de crear un peligro de seguridad, lo que puede impedir su uso en las clases de laboratorio de grado. Nuestro protocolo se muestra cómo se vierta geles múltiples proteínas simultáneamente por reciclaje de cartuchos de Invitrogen NuPAGE Novex minigel, y barato materiales comprado en una tienda de mejoras para el hogar. Este método económico y eficiente incluye una forma de almacenar los geles a 4 ° C durante unas pocas semanas. Al reutilizar los cartuchos de gel de plástico de los geles disponibles en el mercado, los laboratorios que se ejecutan frecuentes geles de proteínas puede ahorrar costos significativos y ayudar al medio ambiente. Además, las cintas de plástico de gel son extremadamente resistentes a la rotura, lo que los hace ideales para aulas de laboratorio de grado.
Protocol
1. Preparación de los casetes
- Limpie la parte delantera y trasera de las placas de un cassette de utilizar Invitrogen NuPAGE Novex minigel, o cassette otra minigel comercial.
- Preparar ml aproximadamente 1-3 de epoxi de plástico y mezclar bien de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Aplicar el epoxi hasta el borde interior de la placa frontal, donde las dos placas entrarán en contacto cuando la casete está montado.
- Deslice un trozo de papel de filtro o de cartón a través de la rendija inferior de la placa posterior, cuando el montaje de la casete para evitar exceso de epoxi de sellar la abertura. Quitar el papel de filtro tan pronto como las dos placas se ensamblan.
- Colocar clips de la carpeta a lo largo de los bordes para un cierre hermético, y dejar reposar toda la noche los casetes de la resina se cure completamente.
- Sellar la hendidura en la parte inferior de la placa posterior con cinta eléctrica.
2. Verter el gel de resolución
- A un matraz de brazo lateral de 125 ml, añadir el siguiente:2,25 ml de Tris-base 4X gel de resolución de tampón de pH 8,70, 3,50 ml de 30,8% de acrilamida / bisacrilamida, 3,25 ml de Tipo I agua de grado reactivo (IRG-H 2 O) para un volumen total de 9 ml.
- De los gases de la solución durante 10 minutos en fijar el brazo lateral del matraz a un aparato de vacío, y la colocación de un tapón invertida en la parte superior del matraz.
- Transferir el 9 ml de solución desgasificó a un 50 ml desechable tubo de centrífuga de polipropileno y añadir 30 l de persulfato ammounium 10% (APS) y 6 l de N, N, N ', N', N-tetrametiletilendiamina (TEMED) y mezclar bien por agitación de la solución para evitar la introducción de burbujas.
- Inmediatamente se vierte la solución en el cassette, lo que permite que se ejecute por el lado del cassette para evitar las burbujas que se formen entre las placas de gel. Llenar el casete a aproximadamente 2 cm desde el borde superior de la parte delantera (más corto) plato.
- Suavemente añadir 0,5 ml de 1-butanol saturado con 1X tampón de gel de resolución y dejar que el gel de polimerizar durante 1hora.
3. Verter el gel de apilamiento
- Añadir el siguiente a un matraz de brazo lateral de 125 ml: 0,75 ml de Tris-base 4X pH apilamiento tampón de gel de 6,80, 0,40 ml de 30,8% de acrilamida / bisacrilamida, 1,85 ml de GRI-H 2 O para un volumen total de 3 ml.
- De los gases de la solución durante 10 minutos tal como se describe en el paso 2.
- Mientras que la solución de gel de apilamiento se desgasificación, se vierte el 1-butanol saturado con 1X tampón de gel de resolución de la parte superior del gel de resolución. Lavar la parte superior del gel de resolución una vez con GRI-H 2 O. Vierta el agua y utilizar un papel secante o de filtro Whatman para absorber todo el líquido restante.
- Retire 3 ml de la solución desgasificada y añadir 9 l de 10% de APS y 2 l de TEMED y mezclar bien.
- Rápidamente se vierte la solución en el cassette, lo que permite que se ejecute por el lado de la cassette hasta que está cerca del borde superior de la placa frontal de gel más corto.
- Insertar un peine de gel limpio en la parte superior de la casete de gel,colocar un clip de ligante en la cinta sobre el peine para mantenerlo en su lugar. Que el gel de apilamiento polimerizar durante 1 hora para la noche.
4. Almacenar el gel
- Cuando el gel ha polimerizado por completo, quitar los clips de la carpeta y colocar el cassette en una bolsa de plástico termosellable, o una bolsa de plástico resellable.
- Verter 20 ml de 1X tampón de gel de apilamiento que contiene 0,1% de azida de sodio en la bolsa.
- Calentar sellar la bolsa durante 5 segundos y asegúrese de que no haya fugas en la bolsa.
- Guarde el gel a 4 ° C.
5. Preparación de las muestras
- En un tubo de microcentrífuga de paredes finas, añadir hasta 6,5 l de muestra de proteína, 7,5 l de 2x Novex Tris-Glicina tampón de muestra SDS, 1 mM de ditiotreitol l de 100 (DTT) y GRI-H O 2 (si es necesario) para una volumen total de 15 l.
- Mezclar la muestra por agitación, y brevemente centrifugar la muestra para llevar el contenido al fondo del tubo. <li> Desnaturalizar la muestra a 70 ° C durante 10 min.
6. Correr el gel
- La instalación del equipo de gel Novex.
- Añadir 200 ml de tampón de Tris-glicina que contiene 500 l de antioxidante NuPAGE a la cámara interior, y 300 ml de Tris-Glicina Ejecución de tampón a la cámara exterior.
- Cargar las muestras de proteínas desnaturalizadas (15 l) en los pocillos utilizando un gel de carga punta de la pipeta.
- Correr el gel a 200 V durante 60-70 min.
7. La tinción del gel
- Quitar el cassette del aparato gel y romper el sello epoxi haciendo palanca las dos placas de plástico de gel de separación utilizando un cuchillo de gel o una espátula rígida. Separar cuidadosamente el gel de las placas, teniendo cuidado de no romper el gel.
- Enjuague el gel con GRI-H 2 O tres veces con una suave agitación.
- Teñir el gel con Invitrogen SimplyBlue SafeStain durante 1 hora con agitación suave.
- Retirar la solución de tinción ydestain el gel con GRI-H 2 O.
8. Limpieza de los casetes
- Use una espátula de metal para raspar o se desprenden todos los epoxi en los cassettes para que puedan ser reutilizados de nuevo.
- Lavar cada una de las placas de gel de plástico con una solución detergente suave y enjuague bien con agua corriente seguido de agua destilada.
9. Los resultados representativos
Debido epoxi se forma un sello estanco al agua, (Figura 1), los cassettes no se escapará cuando la solución de acrilamida se vierte en ellos. Además, los cassettes de gel se puede abrir fácilmente para recuperar el gel para la tinción, y la resina epoxi puede despegarse de los cassettes para permitir su reutilización continua. Como se muestra en la Figura 2, el gel muestra clara separación de los marcadores de proteínas y bandas de muestras adecuadas para la electroforesis de proteínas de rutina.
Figura 1. Aplicacionescatión de epoxi para sellar casetes minigel. Una fina capa de epoxi se aplica al borde de uno de los casetes antes del montaje. Para poner de relieve la resina, que era falsa-de color rojo en esta imagen.
Figura 2. La separación de proteínas en un gel de SDS-Tris-glicina vertió utilizando reutilizados casetes minigel. SDS-PAGE se realizó como se describió anteriormente. Después de la electroforesis el gel se retiró del casete minigel, se tiñeron en SimplyBlue SafeStain como por las instrucciones del fabricante, y se fotografiaron utilizando luz transmitida blanco. Carril M contiene SeeBlue Plus2 pre-manchado estándares de proteína. Los pesos moleculares de las proteínas en carril M se indica en el lado derecho del gel en kilodaltons (kDa). Los carriles de otras proteínas de mostrar un lisado aclarado a partir de bacterias que expresan una glutatión-S-transferasa (GST)-etiquetado de proteínas. Las proteínas se muestran en los lavados de la glutathione antes de la elución de la proteína GST-etiquetados perlas.
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Discussion
La electroforesis de proteínas en gel es un método indispensable para los laboratorios de biología molecular mayor. Minigeles comercialmente disponibles proporcionan un alto nivel de comodidad, pero puede ser costoso. Aquí te mostramos cómo volver a utilizar los casetes MiniGel de una popular marca de minigeles disponibles en el mercado. Este método conserva la conveniencia de tener una fuente ya preparada de geles, pero a una fracción del coste de minigeles comercialmente disponibles. Una etapa clave en este procedimiento es aplicar la cantidad correcta de epoxi para sellar completamente los casetes antes de añadir la acrilamida no polimerizada para evitar fugas. Utilice epoxi único que está clasificado para plástico, y permitir suficiente tiempo para la polimerización de la resina epoxi como se describe en las instrucciones del fabricante. Para mayor comodidad, casetes múltiples pueden ser sellados y almacenados antes de verter los geles. Al verter el gel de resolución, asegúrese de dejar suficiente espacio para el gel de apilamiento, típicamente alrededor de 0,5 cm mayor que la altura de los tél peine usados para formar los pocillos. Durante la polimerización del gel de resolución, mantener el gel en posición vertical tal que el tampón-1-butanol saturado se formará una superficie recta y plana para formar en la parte superior del gel de resolución. Si el gel no se polimeriza dentro de 30 min, la cantidad de 10% APS y TEMED puede aumentar. Una vez que el gel se haya terminado de ejecutarse, es importante para romper cuidadosamente el sello epóxico para evitar rasgar la delgada capa de gel. El método que aquí de volver a utilizar casetes comerciales de gel puede ahorrar costos significativos asociados con la frecuente utilización de SDS-PAGE. Los cassettes mismos puede ser reutilizado por muchos años y no tenemos ninguna evidencia de que el uso repetido de la misma placa reduce su utilidad. Además, los geles múltiples pueden ser preparados y almacenados durante semanas en una bolsa de película de poliéster barrera que contiene una pequeña cantidad de 1X tampón de gel de apilamiento que contiene 0,1% de azida sódica.
Abreviaturas:
Ditiotreitol (DTT), N, N, N ', N', N-tetrametiletilendiamina (TEMED), Tipo I agua de grado reactivo (IRG-H2O), persulfato ammounium (APS), dodecil sulfato sódico (SDS), Tris (hidroximetil) aminometano (Tris-base), N, N'-metilen-bis-acrilamida (bis -acrilamida)
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Instituto Médico Howard Hughes de una Ciencia de UF para el premio de la vida a AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
References
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
