Summary
ロイシンリッチリピートキナーゼ2は、大規模なマルチドメインのキナーゼ、パーキンソン病の最も一般的な遺伝的原因であるの変異です。このタンパク質のキナーゼ活性の分析は、このタンパク質の生物学と機能障害を理解する上で重要なツールであることが証明されている。本論文では、
Abstract
ロイシンリッチリピートキナーゼ2（LRRK2）はGTPaseドメイン（複合タンパク質のRasのために、ROCと呼ばれる）とキナーゼドメイン1を含む複雑な、マルチドメイン構造を有する、タンパク質のROCOファミリーの2527アミノ酸のメンバーです。パーキンソン病（PD）を引き起こすLRRK2の突然変異の2004年の発見は、その正常な機能の研究の膨大な量の焦点であることLRRK2をもたらし、どのようにタンパク質が病気の状態2,3でゆがんで行く。 LRRK2の機能への初期の調査では、その酵素活性4-6焦点を当てた。鮮明な画像が変異によりこれらの一貫した変化の出現にまだあるが、グループの数のデータは、突然変異7,8にリンクされている細胞死におけるLRRK2のキナーゼ活性の重要性を強調している。最近の出版物は、主要な実験ツール9-11を提供し、LRRK2のキナーゼ活性を標的とする阻害剤を報告している。これらのデータに照らして、それ彼らはパーキンソン病のための潜在的な創薬ターゲットであるかどうか議論の余地があるがLRRK2の酵素的性質は、このタンパク質の生物学への私たちに重要なウィンドウを買う余裕がいる可能性があります。
異なるアプローチの数は、アッセイLRRK2のキナーゼ活性をするために使用されている。当初は、アッセイはアッセイで、哺乳動物細胞株で過剰発現し、免疫エピトープタグ融合タンパク質を用いて実施されたアガロースビーズ4,5,7に固定化されたこのタンパク質を用いて行った。その後、溶液中のLRRK2の組み換え断片を精製することもLRRK2 12の2527年に残基970を含む昆虫細胞から精製されたGSTタグ付きフラグメントは、例えば、使用されている。最近、ダニエルらヒト胚性腎細胞からのソリューションの完全な長さのLRRK2の分離を報告した、しかし、この蛋白質は13広く利用されていないです。対照的に、LRRK2のGST融合切断型が市販さavailablですE（Invitrogen社から、詳細は表1を参照）、およびLRRK2のキナーゼ活性のアッセイを実証するための便利なツールを提供しています。 LRRK2のキナーゼ活性のためのいくつかの異なる出力が報告されている。モエシンにおけるスレオニン558のリン酸化に基づいて名付けられたLRRKtide、 - - LRRK2自体の自己リン酸化、人工基質の一般的なキナーゼの基質とリン酸化などのミエリン塩基性タンパク質（MBP）のリン酸化は、すべての推定生理学的基質のシリーズを持っているとして、使用されているα-シヌクレイン、モエシンと4 - EBP 14-17など。 LRRK2の基質として、これらのタンパク質の状態は不明のままである、とそのようなプロトコルは以下に説明するようにすると、潜在的な基質の範囲に対して向けられたアッセイLRRK2のキナーゼ活性には、このシステムの有用性を指摘し、汎用的な基質としてMBPを使って焦点を当てます。
Protocol
安全性
以下に記述されたプロトコルは、ATPがLRRK2のキナーゼ活性に従うようにγのリン酸の位置にある放射性32 Pで標識利用しています。それは材料と正確な条件は機器やプロトコルなどのガイドとして取られるべきである我々の研究室で使用される標準のプロトコルに基づいており、そのゲルの実行などの処理の手順の多くに関して、 とceteraウェスタンブロットされこれらのプロセスで使用されるには、研究室から研究室に異なります。電離放射線放出する同位元素を含む化合物は、機関と国レベルで人間の健康と厳格なライセンシングと規制への潜在的に有害であり、その使用を制御します。このプロトコルでの実験は、（ガイドラインAVA大学での安全性サービスによって提供された優良試験所の診療ガイドラインカレッジロンドン大学のオープンソースの放射線利用の訓練に続いて、以下を実施したでilable http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ）。オープンソースの放射線の使用は、適切な訓練と規制当局の承認の前に実行しないでください。実験室研究におけるオープンソースの放射線の責任規制機関は、国によって異なる。これらの例は次のとおりです。イギリスで、安全衛生執行（ http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm米国では）、原子力規制委員会は、（ http://のwww.nrc.gov /素材/ミオー/ regsは-ガイド- comm.html ）、カナダカナダ原子力安全委員会（でhttp://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ）、およびドイツダスBundesamtこだわりStrahlenschutzで（ HTTP ：/ / www.bfs.de /解除/ BFS ）。他の国のユーザーはそれらの放射線安全管理者とローカルルール、規制とライセンシング機関を確認する必要があります。このプロトコルに関連する安全上の注意は、放射性三つ葉形のシンボルを強調表示、テキストに記載されている（ 
）。
1。キナーゼ反応の準備
すべての反応混合物は、放射能のまん延を防ぐために、Oリングが含まれているスクリューキャップと1.5ミリリットルのサンプルチューブに用意。
- 氷上で融解蛋白質 - LRRK2野生型、D1994A、G2019S。
- 氷上で反応を作る - 10nmのLRRK2、水で50μlのために作ら0.5μg/μlMBP、10 ×キナーゼバッファーの5UL、。
2。アッセイを実行する
32 P ATPを利用するすべてのステップは、pを取る必要があります指定された放射線地域でのレース。
適切な個人用保護具を着用してください - 私たちの研究室での標準業務手順書の下で、これらは白衣、二重手袋および保護眼鏡を含む。
32 P ATPを含む試料を曝露を最小限にするために、6ミリメートルパースペックスの画面でユーザから遮蔽する必要があります。
適用可能な、個人的な監視装置を使用する必要がどこに - UCL内で、任意の認定されたオープンソースの放射線のユーザーは、実験中の放射線被ばくを監視するためのフィルムバッジを持っている必要があります。
すべての実験的な面は、芸を使って使用前と使用後の放射能汚染のために評価すべきであるドイツカウンタ。
すべての汚染の可能性のある消耗品は、放射性廃棄物処分のための制度のガイドラインを厳守で処分されるべきである。
- アッセイを始める前に、° Cおよび100 ° Cをそれぞれ30に加熱ブロックを設定する
- -20フリーザー（保管条件は、往復32 P ATPが使用されてradionucleotidesの供給者またはタイプによって異なる場合があることに注意）から32 P ATPを削除します。
パースペックス画面の後ろに解凍、使用前に容器の外にスキャンする。 - 氷上で反応して、冷たいATPの10μMと共に、それぞれに32 P ATPの1μlを加える。
- ピペットでよく混ぜる。 パルスは、汚染のリスクを最小限に抑え、チューブの底に液体持って遠心。
- ゼロ時間のポイントの15μlアリコートを削除するD 100 4X SDSサンプルバッファーと変性5μlの添加による一定量の反応℃で10分間を終了。 パルスは、汚染のリスクを最小限に抑え、チューブの底に液体持って遠心。
- 残りのサンプルでは、加熱ブロック内に配置し、60分間30℃でインキュベート。
- 15μlの100 4X SDSサンプルバッファーと変性5μlの中に加え℃で10分間で終了して60分の時点と反応で除去する。 パルスは、汚染のリスクを最小限に抑え、チューブの底に液体持って遠心。
3。サンプルを免疫ブロッティングし、結果を分析
- SDS - PAGE上で動作するサンプル
- 10も4から12パーセントビス - トリスのポリアクリルアミドゲルは、MOPS泳動バッファーを用いて電気泳動のために準備。
- 各サンプルの20μlのはシャープの7μlと一緒にゲル上にロードTainのタンパク質標準はしご。
- ゲルは、90分間160Vで動作、または色素フロントがゲルの端に達するまで。 放射性同位体と接触するすべての液体は、放射性廃棄物として扱われ、制度的なガイドラインに従って廃棄してください。液体放射性廃棄物が大量の水で指定された放射性廃棄ヒートシンクを下に注ぐことによって破棄されなければなりませんUCL規制状態。
- タンパク質はウェスタンブロットを経由して PVDF膜に転写した。
- 転送バッファは、1 ×トリスグリシンを加えた20％のメタノールを準備した。 PVDFメンブレン、ろ紙、ゲルのサイズを修正するためにカットし、ろ紙の場合の転送バッファを有する膜またはプリウェットの場合には氷河のメタノールで活性化。膜は、配向性の識別を可能にするためにボールペンインクであらかじめ標識する必要があります。 ゲルプラストから削除ICケーシングと過剰アクリルアミドは、放射性廃棄物として除去し、処分。
- ゲルは、気泡が膜とゲルの間に存在しないことを確実に、メンブレンおよびフィルターペーパーでサンドイッチ状に形成し、ゲルとアノードとの間の膜とウェスタンブロット装置内に配置する必要があります。
- 転送は、16時間25Vで実施。
- 転送バッファは、1 ×トリスグリシンを加えた20％のメタノールを準備した。 PVDFメンブレン、ろ紙、ゲルのサイズを修正するためにカットし、ろ紙の場合の転送バッファを有する膜またはプリウェットの場合には氷河のメタノールで活性化。膜は、配向性の識別を可能にするためにボールペンインクであらかじめ標識する必要があります。
- PVDFに蛋白質の転送に続いて、メンブレンを室温で乾燥させる。最後に、乾燥した膜は酢酸セルロースシートの間に分離し、蛍光体の画面または放射性標識タンパク質の検出を可能にするためにX線フィルムのいずれかに公開される必要があります。露光時間は、使用される放射性同位元素と反応の酵素反応速度の比活性に応じて週にわたって、数時間から実行することができます。
- Phosphoscreenは、処理/フィルムをスキャン。蛍光体の画面を使用している場合、画像はフィルムを使用する場合はその後結果トランジェント、高解像度のTIFFまたはビットマップファイルとして保存する必要がありますsparencyは、デスクトップスキャナを使用してスキャンし、高解像度のTIFFまたはビットマップファイルとして保存する必要があります。イメージは、ImageJの、健康のウェブサイトの国立研究所（上で利用可能なフリーウェアのプログラムで解析することができますhttp://rsbweb.nih.gov/ij/ ）。
4。代表的な結果
図1は、アッセイの一般的なリン酸受容体基質としてミエリン塩基性タンパク質と野生型、G2019SとD1994A LRRK2を用いて行うための代表的な結果を示しています。 LRRK2の自己リン酸化は20 - 40kDaから見えるリン酸化MBPを表す複数のバンドで、≈200kDaで表示されます。 D1994A（キナーゼデッド）レーンでの自己リン酸化の有無に注意してください、と原因G2019S変異にリン酸化を増加。キナーゼデッド車線でもMBPの残留リン酸化に注意してください。これは、D1994A変異によるLRRK2のキナーゼ活性の不完全なアブレーションによるものやプレゼンスOを反映しているのかもしれないfは反応の汚染キナーゼをトレース。
図1。
Discussion
本論文では、in vitroの系で使用してLRRK2のキナーゼ活性を測定するための基本的なプロトコルを説明しています。簡潔の利益のために、これは一般的な基板を使用して1時間のエンドポイントのテンプレートに限らず、一般的なプロトコルは、潜在的な基質の範囲に適用し、LRRK2のキナーゼ活性の動態を調べる、より高度な分析に適しているされています。これは、このようなタンパク質のキナーゼの挙動を調べるためにin vitroの系で使用しての重要な利点の一つに焦点を当てています。酵素と基質の濃度を完全に制御があるので、それは運動データを生成し、K mを計算することが可能です。反応のためとVmax値。より詳細な速度論的評価のためにまたは推定される阻害剤の影響を評価する、より高いスループットのシステムは、（そのようなLRRKtide基板を使用することによって与えられるものと、Invitrogen社から入手可能）に優れalternatiですここで説明したアプローチにVEの使い方。
それが重要である、しかし、in vitroでのキナーゼアッセイでで提供される還元主義モデルシステムであることを認識するが、1つのツールでは、キナーゼおよび潜在的な基質との関係の生物学を検討する。このようなアッセイからのデータは、キナーゼは、in vitroおよび細胞の文脈でどのように動作するかの包括的な画像を得るために他のアプローチと組み合わせて使用する必要があります。例えば、in vitroでリン酸化推定基板は、その後、機能を調べるために標的特異的変異誘発（ 例えば、。などアラニンなどなし-リン酸化可能な残基にセリンまたはスレオニンリン酸受容体の残基を変換する）ことによって操作できる可能phosphositesを識別するために、質量分析によって解析することができますリン酸化のex vivoでの結果。
このようなin vitroでのアッセイシステムからデータの解釈に重要な考慮事項は、eitheの可能性です。RタイプIまたはタイプII（偽陽性または偽陰性）のエラー。このシステムの還元主義の性質が、残念ながら両方にそれを破棄する - 前者の場合には、精製された推定上の基質を有する人工的に近く、かつ高濃度（細胞環境と比較して）でのキナーゼを精製することartefactualリン酸化事象が発生する可能性があります。逆に、多くのキナーゼは、細胞のコンテキスト内で複合体の一部として機能し、発生する特定の基質のリン酸化のために補助因子を必要とする。上述したように、推定上の基質のリン酸化から肯定的な結果は 、in vitro のアッセイ系で使用しては、その結果を検証するためのセルラーシステムでテストする必要があります、と否定的な結果は慎重に解釈されるべきである。
これに照らして、それは興味のあるキナーゼの活性の比較研究を可能にするために、正と負の両方のコントロールを持つことが可能どこが重要です。正のcontroの慎重な選択あなたの推定上の基質をリン酸化する可能性は低いネガティブコントロールと一緒に、目的のタンパク質に向かって、既知の活性を有するLは、非常に貴重です。 LRRK2のための一つの候補のコントロールは、LRRK2のキナーゼドメインに密接に関連する一次配列を持っているが、非常に異なる全体的なドメイン構造18を有するキナーゼ3を、相互作用する受容体です。これは、Invitrogenから組換えタンパク質として利用可能であり、当研究室で標準のコントロールとして使用されます。
これは、LRRK2の市販の形態は、タンパク質のN末端を欠いているとグルタチオン- S -トランスフェラーゼとは、このタグ付けされているこのタンパク質をキナーゼアッセイを行う際に、潜在的な交絡因子として考慮されるべきであることにも留意する必要があるそれが知られていないとして、LRRK2のN末端は、このタンパク質の正常な機能にどのような役割を果たす可能性があります。例えば、タンパク質には存在しないLRRK2のN末端部分は、このプロトコルで使用する場合、その後、これは上述のin vitroの系で基板を前記観測されたリン酸化に大きな影響を与えるLRRK2のキナーゼドメインに特異的な基質の動員に重要である。
てもこれらの点に注意し、しかし、パーキンソン病研究にLRRK2の生物学に接続されている重要性は、in vitroでの設定でこの蛋白質の動作を調べるための貴重なツールとして、このプロトコルの有用性を強調。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者は、パーキンソン病、英国研究員（助成F1002）です。この作品は、メンバーが神経のUCL大学、シェフィールド大学とMRCのタンパク質リン酸化のユニットでからのものである英国パーキンソン病のコンソーシアムへの神経変性賞でウェルカムトラスト/ MRCジョイントコール（WT089698）（UKPDC）によって部分的にサポートされていましたダンディーの大学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signaling Technology | 9802S | |
| MBP | Sigma-Aldrich | M1891 | |
| 32P g ATP | PerkinElmer, Inc. | BLU002X500UC | 500μCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 | |
| Table 1. Reagents | |||
| Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps | |||
| Geiger counter | Mini Instruments | ||
| SDS PAGE tank | Invitrogen | ||
| Transfer tank | Invitrogen | ||
| Heat blocks (2) | Eppendorf | ||
| Phosphor screen | GE Healthcare | X-ray film can be substituted | |
| Phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Exposure cassette | GE Healthcare | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Perspex shielding | |||
| 1.5ml tubes | VWR international | Screw top with O ring | |
| Table 2. Equipment | |||
References
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).
- Paisan-Ruiz, C. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44, 595-600 (2004).
- Zimprich, A. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44, 601-607 (2004).
- West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).
- Gloeckner, C. J. The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity. Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).
- Lewis, P. A. The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).
- Greggio, E. Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin. Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).
- Smith, W. W. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity. Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).
- Deng, X. Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2. Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).
- Lee, B. D. Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson's disease. Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).
- Nichols, R. J. Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson's disease. The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).
- Anand, V. S. Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays. FEBS. J. 276, 466-478 (2009).
- Daniels, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).
- Jaleel, M. LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity. Biochem. J. , (2007).
- Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications. Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).
- Imai, Y. Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila. Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).
- Greggio, E. The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation. J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
