Summary
Calmodulina (CaM) pull-down de ensayo es una forma efectiva para investigar la interacción de la CAM con varias proteínas. Este método utiliza CAM-sepharose bolas para el análisis eficiente y específica de la CAM-proteínas de unión. Esta es una importante herramienta para explorar la señalización CAM en la función celular.
Abstract
Calcio (Ca 2 +) es un ion fundamental en la regulación de la función celular a través de una variedad de mecanismos. Gran parte de Ca 2 + señalización está mediada por la proteína de unión a calcio se conoce como la calmodulina (CaM) 1,2. CAM está involucrado en múltiples niveles en casi todos los procesos celulares, incluyendo la apoptosis, el metabolismo, la contracción del músculo liso, la plasticidad sináptica, el crecimiento del nervio, la inflamación y la respuesta inmune. Una serie de proteínas ayudan a regular estas vías a través de su interacción con la CAM. Muchas de estas interacciones dependen de la conformación del CAM, que es muy diferente cuando se une a Ca 2 + (Ca 2 +-CaM) en oposición a su Ca 2 +-estado libre (ApoCaM) 3.
Aunque la mayoría de las proteínas diana se unen Ca 2 +-CAM, sólo ciertas proteínas se unen a ApoCaM. Algunos CAM se unen a través de su coeficiente intelectual es de dominio, incluyendo neuromodulin 4, neurogranina (Ng) 5, y algunas miosinas
Los efectos de estas proteínas en la función celular a menudo dependen de su capacidad para unirse a la CAM en una Ca 2 +-dependiente. Por ejemplo, hemos probado la relevancia de Ng-CAM vinculante en la función sináptica y cómo las diferentes mutaciones afectan a esta unión. Hemos generado una estafa GFP-etiquetados Ngestructura con mutaciones específicas en el CI en el dominio que iba a cambiar la capacidad de Ng a unirse una webcam en una Ca 2 +-dependiente. El estudio de estas mutaciones diferentes nos dio una gran comprensión de los procesos importantes que intervienen en la función sináptica 8,15. Sin embargo, en estos estudios, es esencial para demostrar que las proteínas mutadas se espera que la unión a CaM alterado.
A continuación, presentamos un método para probar la capacidad de las proteínas que se unen a CAM en la presencia o ausencia de Ca 2 +, con CaMKII y Ng como ejemplos. Este método es una forma de cromatografía de afinidad a que se refiere como una cámara desplegable ensayo. Utiliza CAM-Sepharosa cuentas para poner a prueba las proteínas que se unen a la leva y la influencia de Ca 2 + en este enlace. Es un tiempo considerablemente más eficiente y requiere menos proteína en relación con la cromatografía de columna y otros ensayos. En conjunto, esto proporciona una valiosa herramienta para explorar Ca 2 + / CAM y señalización de las proteínas que, encontrarrestar con la CAM.
Protocol
Refiérase a la Figura 1 para un esquema básico de principios procedimiento con el homogeneizado. Tiempo estimado de preparación de extractos celulares de elución de la CAM con destino proteínas es de aproximadamente seis a siete horas.
1. Preparación de tejidos
- Inyectar organotípicos rodajas de hipocampo con un virus que contiene un plásmido que expresa la proteína recombinante de interés (en este ejemplo, la proteína verde fluorescente (GFP)-etiquetados Ng) y permitir que el tejido que expresan la proteína durante la noche.
- Aproximadamente 12 a 18 horas después de la inyección viral (dependiendo de la época la expresión viral), se preparan para recoger el tejido. Añadir 1 ml de buffer de la disección (glucosa 10 mM, 4 mM KCl, 26 mm de NaHCO3, 233mM sacarosa, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl 2, y el 0,1% de fenol-rojo, cámaras de gas con 5% de CO 2 95% O 2) a una placa de Petri. Transferencia de cultivo de tejidos / inserción de placa de Petri y añadir 2 ml de búfer disección de la inserción a sumergir el tejido.
- Recolecciónt organotípicos tejido del hipocampo (entre 5 y rodajas de 10), raspando suavemente en el tejido libre de la membrana insertar utilizando un bisturí. En concreto la eliminación de una determinada región de interés (por ejemplo, CA1) es también una opción. Transferir el tejido suspendido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con una pipeta Pasteur invertida.
- Centrifugar las muestras a 1.500 rcf durante 1 min para separar el tejido de la memoria intermedia de disección. Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento.
- Para cada sector utiliza, agregar 30 a 60 l de tampón de homogeneización (150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, DTT 1 mM, leupeptina 1μg/mL, chemostatin 1μg/mL, antipain 1μg/mL, pepstatina 1μg/mL, y el 1% Triton X -100) a los tejidos y homogeneizar completamente con mortero.
- Con el fin de eliminar los desechos celulares, centrifugar el homogenado restantes a 1.100 rcf durante 10 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración y evitando la contaminación del sedimento.
- Tomar el 10% del sobrenadante como una muestra de la entrada (muestra 1). Guarde el resto de sobrenadante en hielo durante la preparación de las cuentas de la CaM-sefarosa para su uso en el paso 3.
Nota: El tejido utilizado aquí son organotípicos rodajas de hipocampo. Sin embargo, se podría utilizar las neuronas disociadas o cualquier sistema de cultivo de células. En tal caso, comience por el paso 1.4 después de recoger el tejido de la manera adecuada.
2. Preparación de cuentas de pull-down
En el manejo de las cuentas, es importante para salvar las cuentas y maximizar la eficiencia de las reacciones mediante la prevención de los granos se sequen en los lados del tubo. Para ello, lo mejor es rotar los tubos de su lado, permitiendo que la solución para humedecer los granos en las paredes del tubo, inmediatamente antes de la centrifugación.
- Para cada pull-down, una pipeta 400 l de suspensión Sepharose calmodulina cuentas en un tubo de microcentrífuga de 2 ml con un fla relativamentet-fondo para maximizar el área superficial y la interacción de sus soluciones con las cuentas durante su incubación.
- Centrífuga cuentas en 21.000 rcf durante 30 segundos y retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración. Asegúrese de no molestar a las cuentas.
- Para lavar los granos, añadir 100 ml de tampón de homogeneización respectivos que contienen 2 mM CaCl 2 a las que se utilizan para tirar hacia abajo de Ca 2 +-CAM proteínas de unión y 2 mM EDTA (un quelante conocido Ca 2 +) para los granos tirando hacia abajo ApoCaM proteínas de unión. Golpee suavemente el tubo para volver a suspender cuentas y centrifugar a 1.500 rcf durante 1 min. Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración, asegurándose de no molestar a las cuentas.
Nota: Para todos los pasos de aspiración, se recomienda utilizar una pipeta de punta que tiene una abertura muy bien (por ejemplo, puntas de carga de gel) para permitir la remoción de la solución sin necesidad de retirar cuentas.
3. CAM-sefarosa unión de las proteínas
- Dividir en dos el sobrenadante que contiene las condiciones de un volumen igual. Dependiendo de su estado, agregar la cantidad adecuada de CaCl 2 o EDTA para su sobrenadante hasta una concentración de 2 mM de cada uno.
- Añadir sobrenadante del paso de 1,7 a cuentas de lavado en tampón de homogeneización correspondientes. Golpee suavemente el tubo para mezclar.
- Incubar las muestras a 4 ° C durante 3 horas en un agitador. Vuelva a suspender cuentas cada 30 minutos o más para aumentar la eficiencia de la unión.
- Tubo de centrífuga que contienen las muestras y los granos en 1500 rcf durante 3 min.
- Tome 50μL del sobrenadante como una muestra de la proteína unida (muestra 2) y retirar con cuidado el resto de sobrenadante por aspiración y descarte.
- Lávese las cuentas tres veces como se describe en el paso 2.3 con 100μL de tampón de homogeneización respectivos.
4. Elución
- Añadir 50μL de tampón de elución (50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM y) con la condición opuesta (10 mM Cacl 2 o EDTA 10 mM) a las perlas. Por ejemplo, las muestras que se homogeneizaron y encuadernado en un tampón que contiene Ca 2 + se eluyen en el tampón de elución que contiene EDTA y viceversa.
Opcional: Calentamiento del tampón de elución de 37 ° C antes de añadir a los granos pueden mejorar el rendimiento.
- Incubar solución con los granos a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador. Mezclar el golpeando suavemente el tubo de aproximadamente cada 5 minutos.
- Centrífuga cuentas en 1500 rcf durante 3 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante de 50μL para la unión a proteínas (muestra 3) por aspiración. Asegúrese de no molestar a las cuentas.
- Añadir buffer de proteína de carga para todas las muestras (es decir, proteínas homogeneizado, no consolidados y consolidados, así como los que siguen vinculados a las cuentas).
Nota: Para maximizar la elución (especialmente en el caso de elución ineficiente), añadir 50μL de tampón de elución correspondiente (por ejemplo, agregar buf contiene EDTAfer de cuentas vinculado en CaCl 2) a las cuentas antes de calentar las muestras para ayudar a eluir cualquier proteína restante atado y repita los pasos descritos en el apartado 4.3 para quitar restantes proteínas unidas.
5. SDS-PAGE y Western Blot
Conducta SDS-PAGE y análisis mediante Western blot de sondeo para la proteína de interés y la sonda de una proteína conocida por obligar a CAM en la condición opuesta, como control positivo.
6. Resultados representante
La Figura 2b muestra un ejemplo de un ensayo CAM-pull-down de pruebas de la unión CAM de GFP-etiquetados en comparación con Ng Ng endógeno. Para ello, las buenas prácticas agrarias-Ng se sobreexpresa en nuestras secciones de hipocampo organotípicos noche a la mañana y el tejido homogeneizado fue. El homogeneizado se incubó con Cam-sepharose bolas en presencia de cualquiera de Ca 2 + o EDTA. Homogeneizado de entrada muestra que la GFP-Ng se expresó además endógeno Ng y Ca 2 + / CaM-quinasa dependiente de II(CaMKII). Como era de esperar sobre la base de la unión conocida de Ng endógena (que se ilustra en la fig. 2A), GFP-etiquetados Ng se eluyó en ausencia de Ca 2 + (proteína EDTA unido) y no consolidados en la presencia de Ca 2 + (Fig. 2B) . En cambio, el control, CaMKII, se eluyó sólo en la presencia de Ca 2 + (proteínas) y fue sin enlazar en su ausencia (EDTA). Esto demuestra que las cuentas de CAM están funcionando correctamente y el eluciones eran eficientes. Lo más importante, esto demuestra que las buenas prácticas agrarias-Ng se une a ApoCaM de una manera similar a la forma endógena, lo que sugiere que la etiqueta de las buenas prácticas agrarias no alteren el funcionamiento de nuestra proteína recombinante.
Figura 1. Esquema de la CAM pull-down de ensayo
(A) homogeneizado de tejido se centrifuga para eliminar los restos celulares. Aproximadamente el 10% del sobrenadante se toma como una muestra de la entrada (1). El sobrenadante restante se divide por igual para los diferentescondiciones y los reactivos adecuados (CaCl 2 o EDTA) se añaden a la prueba obligatoria en esas condiciones. Cada sobrenadante (que contiene cualquiera de CaCl2 o EDTA) se carga en el preparado, respectivamente CAM-sepharose bolas y (B) se incuban para permitir la unión. Proteínas no unidos son eliminados (2) y (C) las proteínas unidas (3) se eluyen fuera de las cuentas con tampón de elución (EB), que contiene la condición opuesta a la unión. La composición de proteínas de estas tres muestras de la proteína puede ser analizada mediante SDS-PAGE y Western blot.
Figura 2. A) Esquema de Ca 2 +-dependiente vinculante CAM y elución en los ejemplos de ensayo de pull-down se dan de dos tipos de proteínas que se unen a una webcam en una Ca 2 +-dependiente. Neurogranina (Ng) representa proteínas que se unen apo-CAM y CaMKII representa las proteínas que se unen al Ca 2 +-ricosCaM. CAM se muestra en su estado disociado antes de la incubación con las proteínas de homogeneizado. Una vez que se incuba en condiciones de alta concentración de Ca 2 + (2 mM) o en presencia de un quelante de Ca 2 +, EDTA (2 mM), las proteínas se unen a CAM en consecuencia. Ng se une CAM en la condición de EDTA, ya que es poco o nada de Ca 2 + presentes, y se eluyó de las perlas de la CaM-sefarosa en presencia de Ca 2 +. CaMKII, sin embargo, se unen a CAM en la presencia de altas cantidades de Ca 2 + y se disocia una vez que el Ca 2 + se quelados.
B) Los resultados de CAM ejemplo desplegable ensayo. Esta cifra demuestra el resultado final previsto de una cam-sefarosa desplegable con las muestras probaron para Ng y CaMKII. Tanto el Ng endógeno y las buenas prácticas agrarias Ng-están presentes en las calles de proteínas unidas a la CAM en la presencia de EDTA. No Ng está obligado cuando las muestras se incuban con la CAM en la presencia de Ca 2 +, lo que demuestra que Ng sólo obliga a apo-CAM. Nuestro control positivo, CaMKII, por el contrario, se une a la CaM en presencia de Ca 2 +.
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Discussion
El protocolo al que se utiliza CAM-sepharose bolas para investigar la Ca 2 +-dependencia de la CAM-proteínas de unión. Muchas proteínas se unen una webcam en una Ca 2 +-dependiente. Estas interacciones son de gran importancia dada la cantidad de proteínas de unión a CaM y su papel fundamental en muchas vías de señalización. En este protocolo, la CAM-sepharose bolas se utilizan para separar la CaM proteínas de unión a partir de tejido homogeneizado en la presencia o ausencia de Ca 2 +. Los resultados de este enfoque más simple la comprensión de cómo las proteínas pueden interactuar con la CAM en una Ca 2 +-dependiente. Este enfoque difiere de una técnica muy utilizada en estudios de unión de proteínas, cromatografía en columna, en el que las cuentas de la CaM-sefarosa se encuentran en solución en lugar de fija en una matriz.
Evitar el uso de una columna es una de las ventajas de este enfoque, ya que sin la columna del protocolo es menos tiempo, ya que no hay need para equilibrar una columna o esperar a que la gravedad de flujo continuo. Debido a la virtud de su eficiencia, la cámara desplegable requiere significativamente menos que los tejidos cromatografía en columna y simplifica la preparación de la muestra, como la separación de los desechos celulares de la muestra de la proteína sólo requiere una breve centrifugación para el CAM-sefarosa tirar hacia abajo descrito. Columnas requieren muestras de proteínas que están libres de restos celulares, lo que puede requerir pasos adicionales de purificación. Este enfoque también tiene ventajas sobre otros tire los métodos, tales como co-inmunoprecipitación, que requiere un anticuerpo contra la proteína cebo para la captura y las proteínas que interactúan en la muestra. El uso de un anticuerpo para capturar el cebo de proteína puede ser una limitación como la interacción deficiente entre el anticuerpo y la proteína durante el experimento puede conducir a un tirón hacia abajo ineficiente. Estos problemas potenciales se evitan con el uso de la CAM se describe-sefarosa desplegable.
Sin embargo, comola co-inmunoprecipitación y los ensayos de cromatografía en columna, la CAM-sefarosa pull-down se limita a ex vivo CAM vinculante. Los resultados obtenidos pueden no reflejar la realidad en vivo de interacciones CaM. Por ejemplo, modificaciones post-traduccionales a menudo afectan las interacciones proteína. Este es el caso de neurogranina, cuya interacción con la CAM es impedido por la PKC mediada por fosforilación de su dominio IQ 5. Homogeneizar los tejidos podría alterar modificaciones post-traduccionales, por ejemplo, al permitir que las enzimas como quinasas y fosfatasas para acceder a proteínas diana que normalmente se verían aislados de las enzimas en la célula. La interrupción de la localización y / o compartimentación también podría permitir la unión cuando las dos proteínas que normalmente no tendría la oportunidad de interactuar en la célula. Para minimizar estas reacciones, es importante guardar todas las muestras en el hielo entre la preparación y la carga. También es por esta razón que la incubación de las cuentas es done a 4 ° C. Inhibidores de la fosfatasa u otros inhibidores de la enzima también podría ser añadido a los búferes de homogeneización para ayudar a limitar sus efectos.
Un control positivo es importante para este experimento para asegurarse de que no hay errores significativos ocurridos durante el experimento. También se puede asegurar que las diferencias en las condiciones eran suficientes para provocar cambios conformacionales en la CAM, lo que le permite unirse a las proteínas diferentes en presencia y ausencia de Ca 2 +. Por ejemplo, si no hay señal de la proteína de interés, que podría ser debido a un error de carga u otros posibles errores. Sondeo de otra proteína que se sabe se unen en las otras condiciones (tales como CaMKII en el ejemplo dado) puede ayudar a resolver los posibles errores. Bajo Ca 2 + o Ca 2 + quelante (EDTA por ejemplo), las concentraciones también pueden interferir con los resultados esperados. EDTA se ha utilizado con éxito, pero otros quelantes de Ca 2 + (por ejemplo, EGTA) puede ser más eficaz si se concen aún mayorLos iones son ineficaces. Excesiva CAM-proteína de unión también puede conducir a resultados inesperados, ya que puede saturar la disposición sefarosa CaM cuentas, causando la elución de la proteína, cuando debería estar obligado. Esto se ve en el ejemplo que se muestra como una cantidad relativamente pequeña de las buenas prácticas agrarias-Ng se eluye en la condición de EDTA. La cuantificación de la proteína antes de la incubación con perlas pueden ayudar a mejorar esto.
La preparación adecuada y el manejo de las cuentas de la CaM-sefarosa durante todo el experimento es también esencial para el éxito. Cuentas se puede perder fácilmente durante el experimento, ya sea sin querer quitar con sobrenadante a ser descartados o pegados en los costados y parte superior del tubo de 2,0 ml. Esto puede evitarse mediante el uso de cuidado al eliminar el sobrenadante y asegurar una buena mezcla inmediatamente antes de la centrifugación. Trate de que las muestras se colocan entre la mezcla y centrifugación ya que permite a CAM-sepharose bolas a secar en los lados del tubo. Como medida de precaución, y volver a suspender las cuentas de roTate solución alrededor del tubo con perlas mojada inmediatamente antes de la centrifugación. Inmersión completa de las muestras con las cuentas durante los dos la unión y la incubación de elución es muy importante. Sin mezcla adecuada de la muestra con las cuentas, la unión y la elución es probable que sea ineficiente.
Este protocolo es muy versátil y puede ser fácilmente modificado para otros fines. Llevar a cabo este experimento con proteínas truncadas o mutadas pueden revelar información sobre la región (s) y los residuos de las proteínas que son importantes para la leva obligatoria y Ca 2 +-dependencia, si se observa. En el caso del gas natural, hemos sido capaces de demostrar que las buenas prácticas agrarias-Ng, al igual que la proteína endógena, se une a la CaM sólo en ausencia de Ca 2 + 8. Para explorar la función de este mutaciones vinculante, a diferencia de esta proteína altera su IQ de dominio ayudan a comprender la naturaleza de la interacción Ng con CAM, así como la función de las modificaciones post-traduccionales, que alteran la interacción. Hemos probado la importancia de Ng-CAM vinculante con dos mutantes diferentes: un aspartato phosphomimic en lugar de una serina (S36D o Ng-SD) y un coeficiente intelectual-Ng menos para evitar que la unión a CaM. También genera un mutante (Ng-SFAW) que tiene una mayor unión a CaM, permaneciendo vinculado ni siquiera en presencia de Ca 2 +. Por último, hemos utilizado un mutante no phosphorylatable (Ng-SA) que se une a una webcam en una Ca 2 +-dependiente de manera similar a Ng endógena, pero impide la fosforilación de la proteína quinasa C (PKC). La CAM desplegable ensayo ayudó a probar la funcionalidad de estos mutantes diferentes y ayudó a demostrar la importancia de Ng-CAM vinculante en la función sináptica 8 y cómo la fosforilación Ng ayuda afinar la plasticidad sináptica 15.
Además, las proteínas que se unen a proteínas de unión a CaM podría ser eluido. Esto podría proporcionar nuevas aplicaciones de este ensayo en la determinación de proteínas que se unen indirectamente CaM. Permite el estudio de las relaciones entre ellos otrosiones y otros posibles efectos aguas abajo de la CAM y sus socios vinculante.
En resumen, la CAM pull-down de ensayo proporciona una solución eficiente y eficaz para investigar Ca 2 +-dependencia de las interacciones proteína-CAM. Esto puede ser una herramienta importante para estudiar las interacciones entre proteínas CAM y cómo las diferentes mutaciones o modificaciones pueden afectar a estas interacciones. Esto puede ser útil en la exploración de la regulación de la Ca 2 + / CaM vías de señalización. Además, podemos usar esto para explorar las patologías causadas por alteraciones en Ca 2 + / CaM señalización.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Tiffany de la cereza en su ayuda en la optimización de este protocolo. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional del Envejecimiento (AG032320), así como el avance de una mejor salud de Wisconsin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calmodulin-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0529-01 | |
| Anti-CamKII alpha | Sigma-Aldrich | C6974 | |
| Anti-neurogranin | EMD Millipore | 07-425 | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-138 | Use for aspiration of supernatants |
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-146 | Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads |
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