Mesurer les flux de calcium dans les cardiomyocytes rapide

Summary

Nous présentons une méthode pour isoler rapidement des événements de calcium (microseconde) à partir des flux plus lent dans les cellules vivantes en utilisant microscopie confocale à balayage laser. La méthode de mesures des fluctuations d'intensité de fluorescence des indicateurs de calcium par les analyses en ligne l'enregistrement de plusieurs centaines de pixels dans une cellule. Analyse de l'histogramme nous permet d'isoler les échelles de temps des différents flux de calcium.

Abstract

Cardiomyocytes ont de multiples flux de Ca ^{2 +} d'une durée variable qui travaillent ensemble pour optimiser ^1,2 fonction. Les changements dans l'activité Ca ^{2 +} dans la réponse aux agents extracellulaire est principalement régulée par la phospholipase Cß-Ga voie _Q localisés sur la membrane plasmique qui est stimulée par des agents tels que l'acétylcholine ^3,4. Nous avons récemment constaté que les domaines plasmatique protéine membranaire appelée cavéoles ^5,6 Ga peut piéger activé _q ^7. Ce piège a pour effet de stabiliser l'état activé de Ga _q et entraînant prolongée de Ca ^{2 +} dans les cardiomyocytes des signaux et des autres types de cellules ^8. Nous avons découvert ce résultat surprenant en mesurant les réponses de calcium dynamique à l'échelle rapide dans les cardiomyocytes de vie. Brièvement, les cellules sont chargées avec une lampe fluorescente de Ca ^{2 +} indicateur. Dans nos études, nous avons utilisé Ca ^{2 +} Vert (Invitrogen, enc.) qui présente une augmentation de l'intensité d'émission de fluorescence lors de la liaison des ions calcium. L'intensité de fluorescence est ensuite enregistré pour utiliser un mode de balayage ligne d'un microscope confocal à balayage laser. Cette méthode permet l'acquisition rapide de l'évolution temporelle de l'intensité de fluorescence en pixels le long d'une ligne sélectionnée, produire plusieurs centaines de traces du temps sur l'échelle de la microseconde. Ces traces sont très vite transférés dans Excel, puis dans Sigmaplot pour l'analyse, et sont comparés à des traces obtenues pour le bruit électronique, sans colorant, et d'autres contrôles. Pour disséquer Ca ^{2 +} réponses des débits différents, nous avons effectué une analyse de l'histogramme qui binned intensités des pixels avec le temps. Binning nous permet de regrouper plus de 500 traces de scans et de visualiser les résultats compilés spatialement et temporellement sur une même parcelle. Ainsi, les ondes lentes Ca ^{+ 2} qui sont difficiles à discerner quand les scans sont superposées due au placement de pointe différentes et le bruit, peut être facilement vu dansles histogrammes binned. Flux très rapide dans l'échelle de temps de la mesure montrent une distribution étroite des intensités dans les bacs très peu de temps alors que les plus vagues Ca ^{2 +} montrent des données mis en cellule avec une large distribution au cours des bacs de temps plus long. Ces distributions de temps différentes nous permettent de disséquer le calendrier de flux de Ca ^{2 +} dans les cellules, et de déterminer leur impact sur ​​les différents événements cellulaires.

Protocol

1. Cellules de chargement avec des indicateurs de calcium Cellules de la plaque en 35mm plats en verre MatTek bas (ou tout autre visionnement à fond de verre chambres). Si vous utilisez primaires manteau de myocytes les chambres 1 jour avant avec 10μg/ml laminine. Myocytes cardiaques Plate (isolé de chiens adultes, les rats nouveau-nés, ou autre organisme) en Ko de tampon (buffer Tyrode K-retournement 35 mmol / L de HEPES, 140 mmol / L de KCl, 8 mmol / L de KHCO3, 2 mmol / L de MgCl <…

Discussion

Nous avons développé une méthode pour afficher et d'isoler les signaux calciques dans les cardiomyocytes rapide vivants. Alors que les conditions expérimentales de ces mesures ont déjà été appliquée à des systèmes cellulaires ¹⁰ autres ainsi que des cardiomyocytes ^11, l'utilisation d'histogrammes et de l'analyse permet bin données provenant de nombreuses Ca ^{2 +} des événements devant être acquis. Plus rapide des événements peut être facilement isolé du p…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234