Mätning Snabb Kalcium flöden i Cardiomyocytes

Summary

Vi presenterar en metod för att isolera snabb (mikrosekund) kalcium händelser från långsammare flöden i levande celler med hjälp av laserskanning konfokalmikroskopi. Metoden åtgärder fluorescensintensitet variationer av kalcium indikatorer skannar in raden av flera hundra pixlar i en cell. Histogram analys tillåter oss att isolera tidsskalor för olika kalcium flöden.

Abstract

Cardiomyocytes har flera Ca ^{2 +} flöden av varierande längd som samverkar för att optimera funktionen ^1,2. Förändringar i Ca ^{2 +} aktivitet som svar på extracellulära agenter är främst regleras av fosfolipas Cβ-Gα _q vägen lokaliserad på plasmamembranet, som stimuleras av medel såsom acetylkolin ^3,4. Vi har nyligen funnit att plasmamembranet protein domäner kallas caveolae ^5,6 kan snärja aktiveras Gα _q ^7. Detta entrapment har effekten av att stabilisera det aktiverade stadiet av Gα _q och resulterar i förlängd Ca ^{2 +-signaler} i cardiomyocytes och andra celltyper ^8. Vi upptäckte detta överraskande resultat genom att mäta dynamiska kalcium svar på en snabb skala i levande cardiomyocytes. Kortfattat, är cellerna laddade med ett fluorescerande Ca ^{2 +} indikator. I våra studier har vi använt Ca ^{2 +} Grön (Invitrogen, Ic) som uppvisar en ökning av fluorescens utsläpp intensitet vid bindning av kalciumjoner. Fluorescensintensiteten sedan in för att använda en line-scanningsläge en laserskanning konfokalmikroskop. Denna metod gör snabba förvärv av tiden under fluorescensintensiteten i pixlar längs en markerad linje, som producerar flera hundra tiden spår på mikrosekund tidsskalan. Dessa mycket snabba spår överförs till Excel och sedan till SigmaPlot för analys, och jämförs med spår som erhålls för elektroniskt brus, utan färg, och andra kontroller. Att dissekera Ca ^{2 +} svar av olika flux priser, genomförde vi ett histogram analys som binned pixel intensiteter med tiden. Binning tillåter oss att samla över 500 spår av skannar och visualisera sammanställt resultaten rumsligt och tidsmässigt på en enda tomt. Således kan den långsamma Ca ^{2 +} vågor som är svåra att urskilja när genomsökningar överlagrade beror på olika topp placering och buller, lätt ses iden binned histogram. Mycket snabb flöden i tidsskala mätningen visar en smal fördelning av intensitet på mycket kort tid soptunnor medan längre Ca ^{2 +} vågor visa binned data med en bred spridning över längre tid papperskorgar. Dessa olika tid distributioner tillåter oss att dissekera tidpunkten för Ca ^{2 +} flöden i cellerna, och för att fastställa deras inverkan på olika cellulära händelser.

Protocol

1. Fylla celler med kalcium indikatorer Plate celler i 35mm Mattek glas botten rätter (eller något annat glas botten ser kammare). Om du använder primära myocyter päls kamrarna 1 dag före med 10μg/ml laminin. Plate hjärt myocyter (isolerade från vuxna hundar, neonatala råttor, eller annan organism) i KB buffert (K-återföring Tyrode buffert 35 mmol / L av HEPES, 140 mmol / L KCl, 8 mmol / L KHCO 3, 2 mmol / L av MgCl 2 och 0,4 mmol / L av KH 2 PO 4,</…

Discussion

Vi har utvecklat en metod för att visa och isolera snabb kalcium signaler i levande cardiomyocytes. Medan de experimentella villkoren för dessa mätningar har tidigare använts på andra cellsystem ¹⁰ samt cardiomyocytes ^11, tillåter användning av histogram och bin analys data från många Ca ^{2 +} händelser som ska förvärvas. Snabbare händelser lätt kan isoleras från långsammare ettor och modeller anpassade för att förstå de underliggande mekanismer. Odling cardiomyocytes, s…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234