Måling Fast Calcium Flux i cardiomyocytter

Summary

Vi præsenterer en metode til at isolere hurtig (mikrosekund) calcium begivenheder fra langsommere flusmidler i levende celler ved hjælp af laser scanning konfokal mikroskopi. Metoden foranstaltninger fluorescensintensitet udsving af calcium indikatorer ved at optage linje scanninger af flere hundrede pixel i en celle. Histogram analyse giver os mulighed for at isolere tidsskalaer af forskellige calcium flux.

Abstract

Cardiomyocytter har flere Ca ^{2 +} fluxe af forskellig varighed, der arbejder sammen for at optimere funktion ^1,2. Ændringer i Ca ^{2 +} aktivitet som reaktion på ekstracellulære agenter er overvejende reguleret af phospholipase Cβ-Gα _q sti lokaliseret på plasma membranen, som stimuleres af stoffer såsom acetylcholin ^3,4. Vi har for nylig fundet, at plasma membran protein-domæner kaldes caveolae ^5,6 kan fange aktiveres Gα _q ^7. Dette entrapment har den virkning at stabilisere den aktiverede tilstand Gα _Q og resulterer i en forlænget Ca ^{2 +} signaler i cardiomyocytter og andre celletyper ^8. Vi har afdækket dette overraskende resultat ved at måle dynamisk calcium svar på en hurtig skala i levende cardiomyocytter. Kort fortalt, er celler fyldt med en fluorescerende Ca ^{2 +} indikator. I vores undersøgelser har vi brugt Ca ^{2 +} Grøn (Invitrogen, Ic.), som udviser en stigning i fluorescensen emissionsintensitet efter binding af calcium ioner. Den fluorescensintensitet er derefter registreret for at bruge en line-scan mode for en laser scanning konfokal mikroskop. Denne metode gør det muligt hurtigt at tilegne sig den tid, forløb fluorescensintensitet i pixels langs en markeret linje, der producerer flere hundrede af tid spor på mikrosekund tidsskala. Disse meget hurtige spor er flyttet ind i Excel og derefter ind i Sigmaplot til analyse, og de er sammenlignet med spor opnået for elektronisk støj, gratis farvestof, og kontroller. At dissekere Ca ^{2 +} reaktioner af forskellige flux satser, vi udført et histogram analyse, der binned pixel intensitet med tiden. Binning giver os mulighed for at gruppere over 500 spor af scanninger og visualisere de indsamlede resultater, rumligt og tidsligt på en enkelt plot. Således kan den langsomme Ca ^{2 +} bølger, som er vanskelige at få øje på, når de scanninger er overlejret på grund af forskellige peak placering og støj, være let ses iden binned histogrammer. Meget hurtig fluxe i den tid omfanget af målingen viser en smal fordeling af intensitet på meget kort tid skraldespande mens længere Ca ^{2 +} bølger show binned data med en bred fordeling over længere tid skraldespande. Disse forskellige tid distributioner giver os mulighed for at dissekere timingen af Ca ^{2 +} flusmidler i cellerne, og at fastslå deres virkning på forskellige cellulære events.

Protocol

1. Loading celler med calcium indikatorer

1. Plate celler i 35mm glasbund Mattek retter (eller enhver anden glasbund visning kamre).
2. Hvis du bruger primære myocytes pels kamrene 1 dag før med 10μg/ml laminin. Plate hjerte myocytes (isoleret fra voksne hunde, neonatale rotter eller andre organisme) i KB buffer (K-vending Tyrode buffer 35 mmol / L HEPES, 140 mmol / l KCl, 8 mmol / L KHCO _3, 2 mmol / L af MgCl _2, og 0,4 mmol / L af KH ₂ PO _4, pH 7,5) og ændre det gradvist til M199 medium suppleret med 15% føtalt bovint serum og 1% streptamycin og 0,5% gentamicin og inkuberes ved 37 ° C i 5% CO _2.
3. Inkuber celler med calcium grønne AM (1-5 μM; Molecular Probes) eller enhver ønsket calcium indikator i 30-45 min ved stuetemperatur. Dæk fadet med alufolie for at undgå fotoblegning af farvestoffet.
4. Vask cellerne tre gange med Leibovitz15 medium med 14mm EGTA (Hvis der udføres forsøg i lavt calcium) eller en passende visning medier.
5. Inkuber i en anden 30-45 minutter i Leibovitz15 medium containing14mM EGTA.
6. Hvis testning effekter af inhibitorer (dvs. 10μM U73122 PLC-hæmmer), føje dem i løbet af anden inkubation.

2. Microinjecting celler

1. Kultur cardiomyocytter i glasbund Mattek retter (eller en anden visning kamre) for 24 timer.
2. Skift mellemlangt til phenol-fri Leibovitz-15 med 14 mM EGTA (cardiomyocytter skal injiceres i calcium frit medie, kan andre celler injiceres i medium, der indeholder calcium).
3. Forbered mikroinjektion løsning - vores undersøgelser anvendt et peptid, der eliminerer Gα _q - caveolae interaktioner. Husk, at kun en lille mængde mængde sprøjtes ind i cellen (~ FL) og så med rimelighed koncentrerede bestande skal anvendes. Vi brugte 2 μM af dette peptid, Cav3-stillads, med DAPI i calcium-fri medium. DAPI er en blue farvestof, der pletter kernen og muliggør identifikation af celler, der er blevet microinjected. DAPI ikke interfererer med fluorescens af mange calcium indikatorer. Mængden af ​​DAPI er variabel, og vi generelt bruger nok til at visualisere kernen (0,5 og 2 μM)
4. Forbered kontrol opløsning indeholdende DAPI - farvestoffet sporstof alene.
5. For microinjections benyttes luftforsynet trukket eller kommercielt tilgængelige nåle. Praksis med farvestof indsprøjtning til at bestemme ordentlig nål parametre. Vi bemærker, at forskellige celler kan kræve forskellige nål diametre og mikroinjektion pres.
6. Brug automatiserede mikroinjektion systemet, for eksempel et InjectMan NI2 med en FemtoJet pumpe fra Eppendorf. Indstil indsprøjtningstryk P _i til 90 hPa, og erstatningen trykket P _C til 45 hPa. Indstil injektion tidspunkt t til 0,7 S. Juster parametre for injektion som har brug for.
7. Udfør microinjections på en omvendt mikroskop (f.eks Zeiss Axiovert 200M) udstyret med lange afstand fasekontrast mål (for eksempel luft 40x fase 2 mål).
8. Sprøjt så mange celler som muligt i en hurtig måde. Undersøg injicerede celler ved hjælp af fasekontrast at vælge levedygtige celler.

3. Co-immunfluorescens undersøgelser

1. Vask celler to gange med PBS og fix med 3,7% paraformaldehyd i 30 minutter. Hvis det ønskes, kan cellerne blive stimuleret før fiksering.
2. Vask fast celler tre gange med PBS, og inkuber med 0,2% NP40 i PBS for fem minutter.
3. Bloker bruger PBS indeholdende 4% ged serum (eller andre egnede serum) for en time.
4. Inkuber celler med primær antistof på passende fortynding med 1% ged serum i PBS til en timer.
5. Vask cellerne tre gange i 10 minutter med 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,6 efterfulgt af tilsætning af fluorescerende-mærket sekundært antistof, som Alexa-Fluor-488 anti-kanin eller Alexa-Fluor-647 anti-mus sekundære fortyndede antistof til 1: 1000 1% ged serum i PBS (bemærk, at når sondering for to forskellige proteiner den primære antistoffer skal hæves i forskellige arter, og den sekundære skal være mod tilsvarende arter).
6. Inkuber ved 37 ° C i en time, vaskes tre gange med TBS.
7. Vis celler i TBS buffer eller anden passende visning medium.

4. Hurtig calcium imaging

1. Brug laser scanning konfokal mikroskop (f.eks Fluoview 1000 Olympus).
2. Brug høj numerisk blænde mål.
3. Indstil købet parametre. For calcium grønne bruge 488 nm excitation og lang aflevering 515 emission filtre.
4. Juster pixel tid - til hurtig calcium målinger sæt den til 2 mikrosekunder / pixel.
5. Sæt billedet zoom til at opnå en pixelstørrelse på 0,05 til 0,3 μm.
6. Vælg en linje fra en celle af valg i en bestemt region.
7. I den tid controlleren vinduet vælge tid erhvervelse til mindst 1500 scanninger (for at få den ønskede tidsrammesvaret - 1,3 ms / linie ville give 2 sekunder).
8. Optag baggrund læsning forud for stimulation.
9. Stimulere celler med 5 m carbachol og straks begynder at optage data. Hold cellerne i 1 ml Leibovitz15 medium, forberede 10 ìm carbachol i Leibovitz15 og tilsæt forsigtigt 1 mL til fadet

5. Dataanalyse

1. Uddrag de intensiteter for hver pixel fra optagne billede. Gem intensitet data som en tabel ved hjælp Fluoview 1000 software.
2. Import intensitet data i Sigmaplot eller et lignende dataanalyse-program og bin data i ~ 9-40 spande. Sammenlign med kontrol eksperimenter og elektronisk støj.

6. Repræsentative resultater:

Vi filmede celler på laser scanning konfokal mikroskop LSM510 (Zeiss Jena, Tyskland) er udstyret med multi-line laser excitation og en 40x/1.2 NA apochromat nedsænkning i vand mål. I Fig. 1 (rød) viser vi distribution af caveolae i canine voksne ventrikulære cardiomyocytter, der er blevet faste og farvet med et antistof til caveolin-3 som er den største strukturelle caveolar protein i disse celler ^9. Caveolin-3 blev immunolabelled med Alexa-647 og spændt med 633-nm linje fra en He: Ne laser. Billederne blev optaget med LP650 nm emission filter. Fordelingen af caveolin-3 blev sammenlignet med Gα _q, der blev immunolabeled med Alexa-488 (grøn). Alexa-488 var spændt med 488nm argon-ion laser linje og billedet blev optaget med BP505-530nm emission filter. I disse colocalization målinger, blev de to fluorophores ophidset på en sekventiel måde ved hjælp af Multi Track erhvervelse. Denne procedure minimerer kanal cross-talk. Dataanalyse for colocalization blev udført ved hjælp AIM software, der leveres med Zeiss LSM510-Meta. Som det kan ses, er de to proteiner colocalized.

At bestemme, hvordan koblingen mellem caveolin-3 og Gα 2 + Green. Vi er glade for farvestoffet med en 488nm Argon ion laser og indsamlet billeder gennem et LP515 emission filter. Billede frames blev indsamlet på 500 ms intervaller. Intensitet værdier for hver pixel blev ekstraheret ved hjælp af Olympus software og ImageJ. Linjen scanningstilstand blev brugt til kvantitativ analyse af hurtigere Ca ^{2 +} transienter og Ca ^{2 +} gnister. Pixelstørrelse, der anvendes i nærværende undersøgelse var 0,1-0,3 μm. Den line-scan rate var omkring flere hundrede mikrosekunder per linje. I Fig. 2 viser vi en linje scanning af en Ca ^{2 +} Green-loaded cardiomyocyte hvor pixel dgod tid var 2 mikrosekunder, den linje tiden var 142 mikrosekunder. Billedet er sammensat på 1200 linjer.

Hver linje af scanningen svarer til intensiteten udsving i Ca ^{2 +} Green, der består af 71 punkter overtaget en 142 mikrosekunder sortiment, og kan bruges som en hurtig read-out for calcium svar. For eksempel. I Fig 3 Vi viser Ca ^{2 +} aktiviteten af en enkelt linje af en individuel cardiomyocyte, målt ved Ca ^{2 +} Grøn fluorescensintensitet som en funktion af tiden i sekunder før (øverst) og efter (nederst) tilsætning af 5 m carbachol som forbedrer niveauet af intracellulære Ca ^{2 +} gennem Gα _Q-PLCβ aktivitet. Når mange linjer er gennemsnit, carbachol stimulation producerer en ~ 1,8 gange stigning i Ca ^{2 +} Grøn intensitet. På grund af variationer i eksperimentelle forhold (stuetemperatur, laser magt, detektor svar, farvestof distributioner, osv.), kan denne stigning ikke ses i de enkelteline scanninger. Selv om intensiteten værdier (y-aksen værdier) er ens, er det klart, at carbachol-stimuleret plot på bunden har meget bredere toppe, hvilket svarer til mere vedvarende calcium niveauer, end den snævre toppe set før stimulation. Denne udvidelse og relativ stigning i intensitet tilslører mindre, langsommere svingninger. Vores mål er bedre at skelne mellem disse forskellige tilsyneladende typer af calcium udsving.

Et andet eksempel på disse hurtige calcium udsving er vist i Fig. 4. Den øverste graf viser rå line data for stimuleret ventrikulær cardiomyocytter (rød) og et gennemsnit på 3 linje spor er vist i sort. For at bestemme det omfang disse calcium udsvingene var medieret af Gα _q - caveoline3 interaktioner, vi microinjected et peptid, der destabiliserer caveolin-3 - Gα _q interaktioner (dvs. Cav3 peptid), der fjerner den længere Ca ^{2 +} strøm og disse data er vist i blåt(Vi konstatere, at vi trækkes 500 fra Cav3 peptid intensiteter, således at de to spor bedre kan skelnes).

Vi har importeret de kolonner af rå data fra vores excel filer til Sigmaplot (Jandel, Inc.) og udført et histogram analyse. I denne analyse, er antallet af hændelser inddelt i lige så mange kasser (bins) for at producere et histogram. Bredden af ​​bin repræsenterer et lige interval af tid. De intensiteter er indsat i de forskellige tidspunkter bindes så at højden af ​​en bestemt bin repræsenterer det antal gange, intensitet opstår i særdeleshed tidsvindue. Da denne form for analyse afhænger kun indsamle data på samme scan hastighed, kan mange spor analyseres samtidigt. Desuden er denne analyse er ikke følsom over for forskelle i farve niveauer, laser magt, osv., og elektronisk og baggrundsstøj sker på tidsskalaer meget hurtigt og er kun set i de første 1-2 skraldespande.

De tilsvarende histograms af de rå data i Fig. 4 er vist på bunden af ​​siden. Histogrammet for kontrol celler er spredt over et stort antal beholdere svarende til en bred tid fordeling, som det fremgår af den røde linje (linjen er til at lede øjet, og ingen model antages). I modsætning hertil er de siloer for respons af celler, hvor Gα _q-Cav3 interaktionen blev afbrudt af et peptid begrænset til en smal bin fordeling tyder på, at tilstedeværelsen af peptid eliminerer længere varighed flusmidler. Mikroinjektion af et kontrolsystem peptid, der ikke forstyrrer Gα _q-Cav3 producerer et histogram svarer til FN-indsprøjtning celler ^8.

I Fig. 5 vi sammenligner den hurtige intensiteten udsving af Ca ^{2 +} Grøn hos voksne hunde ventrikulære cardiomyocytter (til venstre) og friske, unstimulated rotte neonatal cardiomyocytter, der mangler caveolae (til højre). Her var de tilsvarende histogrammer for de intensiteter, der i løbet af en 3 minutters periode binned ved 35 til at se langsommere calcium begivenheder. Bemærk, at neonatal cardiomyocytter displayet hurtigt udsving på en flad baseline viser manglende langsommere Ca ^{2 +} aktivitet, mens en mere struktureret baseline ses for de voksne celler. Disse forskelle er lettest ses i histogrammer.

Figur 1. Billeder af hunde voksne ventrikulær cardiomyocytter der viser fordelingen af Gα _q immunolabeled med Alexa-488, hvor Alexa-488 var spændt med 488nm argon-ion laser linje og billedet blev optaget med BP505-530nm emission filter. Den øverst til højre er den samme billedvisning lokaliseringen af ​​caveolin-3 immunolabeled med Alexa-647, ophidset med 633-nm linje fra en He: Ne laser og registreres ved hjælp af LP650 nm emission filter. Den fusionerede billedet, hvor colocalization ses i orange er på den nederste venstre med en udvidet billedet til højre.

"Pdflinebreak">

Figur 2. Calcium billeder af en levende hund voksen ventrikulær cardiomyocyte lastet med Ca ^{2 +} Green. Billedet blev taget på en konfokal scanning laser mikroskop system med en 40x objektiv med en 488nm Argon ion laser og en LP515 emission filter. Billedet er sammensat af 1200 linier, den pixel dvæle tid var 2 mikrosekunder, og pixelstørrelse var 0,1 μm.

Figur 3. TOP Intensitet svingninger af en linje spor fra en levende hund voksen ventrikulær cardiomyocyte lastet med Ca ^{2 +} Grøn og afbildes som beskrevet, og BUND den samme celle stimuleres ved tilsætning af 5 m carbachol.

/ 3505fig4.jpg "/>
Figur 4. TOP Et eksempel på linje spor fra en levende hund voksen ventrikulær cardiomyocyte lastet med Ca ^{2 +} Grøn (rød) taget mere end 180 ms, hvor gennemsnittet af 3 spor vises som en sort streg, og sammenlignet med en celle, der blev microinjected med et peptid, der forstyrrer Gα _q-caveolin 3 sammenslutning (rød), hvor et gennemsnit af tre spor er i sort. Vi noterer os, at vi trækkes 400 intensitet tæller fra den nederste sæt af data til visning formål. Jo lavere paneler er de tilsvarende histogrammer af binned data som beskrevet i teksten, og hvor bin nummer er vilkårlige, og de bin tæller (eller blot tæller) svarer til den samlede mængde af intensitet i den specifikke bin. Vi bemærker, at den linje, røde og blå linjer trukket i kontrolgruppen (venstre) og peptid (højre) histogrammer er at give mulighed for lettere identifikation og sammenligninger af de data og ingen model er antaget.

files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg "/>
Figur 5. Intensitet udsving af Ca ^{2 +} Grøn hos voksne hunde ventrikulære cardiomyocytter (til venstre) og friske, unstimulated rotte neonatal cardiomyocytter, der mangler caveolae (højre) og deres tilsvarende histogrammer er vist nedenfor.

Discussion

Vi har udviklet en metode til at se og isolere hurtige calcium signaler i levende cardiomyocytter. Mens de eksperimentelle betingelser af disse målinger tidligere har været anvendt til andre celle-systemer ^10, samt cardiomyocytter ^11, brug af histogrammer og bin analyse giver mulighed for data fra mange Ca ^{2 +} begivenheder, der skal erhverves. Hurtigere begivenheder kan let isoleres fra langsommere og modeller tilpasset til at forstå deres underliggende mekanismer. Dyrkning cardiomyocytter, som mange primære cellelinjer, kan vanskeligt. Mens det generelt menes at målingerne skal tages kort tid efter celler er erhvervet, har vi fundet, at den voksne hunde cardiomyocytter vi brugte i denne undersøgelse først begynde at miste deres særlige egenskaber efter 3 dage. Denne længere tidsramme gør det muligt for cellerne at fast vedhæfte på underlaget forsikring, at cellerne vil overleve potentielt dødelige behandlinger såsom mikroinjektion. Firm vedhæftet fil er kritiskfor succes mikroinjektion.

Vi verificerede rolle Gα _Q-caveolin 3 forening i calcium flusmidler ved microinjecting et peptid, der forstyrrer deres samspil. Vi vil gerne understrege, at mikroinjektion skal gøres med stor omhu for at minimere skadelige cellen og udsivning af cellulære indhold. Dog skal disse risici være afbalanceret med brug af større diameter nåle, der er nødvendige for at levere en passende mængde af materiale til den relativt store cardiomyocytter. Inddragelsen af ​​et farvestof som DAPI, der gør det muligt at spore, hvilke celler er blevet mikroinjektion er vigtig. Som nævnt er det vigtigt, at for mikroinjektion myocytes er badet i calcium frit medium, og at det injicerede løsninger er også fri for calcium. Tilstrømningen af ​​ekstracellulære calcium igangsætter sammentrækninger og efterfølgende død af celler

Målingerne selv kan tilpasses til andre celletyper, farvestoffer og konfokal lasersystemer til at følge andre hurtige celle arrangementer såsom insoitol 1,4,5 trisphospate og Camp flux, selv om Ca ^{2 +} fluxe er helt sikkert en af de mest komplekse cellulære budbringere. Man skal være forsigtig med at vælge fluorescerende indikatorer, der er ikke let Lysblegede og har en robust og dynamisk fluorescens svar, så lav laser beføjelser kan bruges. Lav laser magt vil også undgå lokal opvarmning, der kunne give anledning til uønskede cellulære effekter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234