Измерение Быстрые потоки кальция в кардиомиоциты

Summary

Мы представляем метод, чтобы изолировать быстрого (микросекунды) события кальция из медленных потоков в живых клетках помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Метод измеряет интенсивность флуоресценции колебания кальция показатели по записи линии сканирования нескольких сотен пикселей в камере. Гистограмма анализ позволяет выделить временные масштабы различных потоки кальция.

Abstract

Кардиомиоциты имеют несколько Са ^{2 +} потоков различной продолжительности, которые работают вместе для оптимизации функции ^1,2. Изменения в Ca ^{2 +} активности в ответ на внеклеточные агенты, в основном, регулируются фосфолипазы Cβ-Gα _д пути локализован на плазменные мембраны, которая стимулируется агентов, таких как ацетилхолин ^3,4. Недавно мы обнаружили, что плазменные мембраны белковых доменов называют кавеол ^5,6 может завлечь активированный Gα _д ^7. Этот захват имеет эффект стабилизации активированного состояния Gα _д и в результате длительного Са ^{2 +} сигналов в кардиомиоциты и другие типы клеток ^8. Мы обнаружили этот неожиданный результат с помощью измерения динамических характеристик кальция на быстрый масштаба в живых кардиомиоцитов. Короче говоря, клетки загружаются с люминесцентными Са ^{2 +} индикатор. В наших исследованиях мы использовали Са ^{2 +} Зеленый (Invitrogen, Вc.), который экспонатов увеличение интенсивности флуоресценции выбросов при связывании ионов кальция. Интенсивность флуоресценции затем записал для использования линейного сканирования режиме лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Этот метод позволяет быстро приобретение временного хода интенсивности флуоресценции в пикселях вдоль выбранной линии, производя несколько сотен раз следы на микросекунды масштабе времени. Эти следы очень быстро передаются в Excel, а затем в SigmaPlot для анализа, и по сравнению с следы, полученные для электронного шума, свободного красителя, а также другие элементы управления. Чтобы вскрыть Са ^{2 +} ответы разной скоростью потока, мы провели анализ, который гистограммы binned интенсивности пикселов со временем. Биннинг позволяет группе более 500 следов сканирования и визуализации обобщило результаты во времени и пространстве на одном участке. Таким образом, медленные Са ^{2 +} волны, которые трудно различить, когда сканирует перекрыты из-за различных пик размещения и шума, можно легко увидеть вbinned гистограмм. Очень быстрые потоки в масштабе времени измерения показывают, узкое распределение интенсивности в очень короткое время бункеров в то время как больше Са ^{2 +} волнам шоу binned данных с широким распределением в течение длительного времени бункеров. Эти различные распределения времени позволяют нам анализировать сроки Са ^{2 +} потоков в клетках, и определить их влияние на различные клеточные события.

Protocol

1. Загрузка клетки с кальцием показатели

1. Пластина клеток в 35 со стеклянным дном блюда Маттек (или любой другой стеклянным дном просмотра камеры).
2. При использовании первичных пальто миоцитов камер 1 день до этого с 10μg/ml ламинин. Пластина кардиомиоцитов (изолированных от взрослых собак, новорожденных крыс, или другой организм) в КБ буфера (K-разворот Tyrode буфер 35 ммоль / л HEPES, 140 ммоль / л KCl, 8 ммоль / л KHCO _3, 2 ммоль / л MgCl ₂ и 0,4 ммоль / л KH ₂ PO _4, рН 7,5) и изменить его постепенно M199 среде, дополненной 15% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% streptamycin и 0,5% гентамицин и инкубировать при температуре 37 ° С в 5% CO _2.
3. Инкубируйте клетки с кальцием зеленых AM (1-5 мкм; Молекулярные зонды) или любое другое кальция показатель на 30-45 мин при комнатной температуре. Обложка блюдо с алюминиевой фольгой, чтобы избежать фотообесцвечивания красителя.
4. Вымойте клетки трижды Leibovitz15 среде с 14мм EGTA (При выполнении экспериментов в странах с низким кальцием) или любую соответствующую СМИ просмотра.
5. Выдержите в течение еще 30-45 минут в среду Leibovitz15 containing14mM EGTA.
6. Если тестирование эффекты ингибиторов (т.е. 10 мкм U73122 PLC ингибитор) добавить их во время второй инкубации.

2. Microinjecting клетки

1. Культура кардиомиоцитов в стеклянным дном блюда Маттек (или других просмотр камер) в течение 24 часов.
2. Изменение средних фенола без Лейбовиц-15 с 14 мм EGTA (кардиомиоциты должны быть введены в среде без кальция, другие клетки могут быть введены в среде, содержащей кальций).
3. Подготовка микроинъекции решение - наши исследования использовались пептид, который устраняет Gα _д - кавеол взаимодействий. Имейте в виду, что только небольшое количество объеме вводится в ячейки (~ FL), и поэтому разумно сосредоточены запасы должны быть использованы. Мы использовали 2 мкМ этого пептида, Cav3-эшафот, с DAPI в бескальциевой среды. DAPI является BluE краситель, который окрашивает ядра и позволяет идентифицировать клетки, которые были microinjected. DAPI не мешает флуоресценции многих показателей кальция. Количество DAPI является переменной и мы обычно используем достаточно, чтобы визуализировать ядра (0,5 и 2 мкм)
4. Подготовка контроль раствор, содержащий DAPI - трассирующими красителя в одиночку.
5. Для микроинъекций использовать самостоятельно вытащил или коммерчески доступных игл. Практика с красителем инъекции, чтобы определить правильные параметры иглы. Отметим, что различные клетки может потребовать разного диаметра иглы и микроинъекции давления.
6. Использование автоматизированной системы микроинъекции, например InjectMan Ni2 с FemtoJet насоса от Эппендорф. Установить давление впрыска P _я до 90 гПа, а компенсации давления Р _С до 45 гПа. Установите время впрыска т до 0,7 s. Отрегулируйте параметры инъекции по мере необходимости.
7. Выполните микроинъекции на инвертированный микроскоп (например, Zeiss AxioveRT 200M), оснащенный большим рабочим расстоянием фазовый контраст цели (например, воздух 40x фаза 2 цели).
8. Inject столько ячеек, сколько возможно в быстрые моды. Изучите вводили клетки с использованием фазового контраста, чтобы выбрать жизнеспособных клеток.

3. Сотрудничество иммунофлюоресценции исследования

1. Вымойте клетки дважды с PBS и исправить с 3,7% параформальдегида в течение 30 минут. При необходимости клетки можно стимулировать до фиксации.
2. Вымойте фиксированных клетках в три раза с PBS, и инкубировать с 0,2% NP40 в ФБР за 5 минут.
3. Блок использовании PBS, содержащий 4% козьего сыворотке (или другого соответствующего сыворотки) для 1 час.
4. Инкубируйте клетки с первичными антителами на соответствующем разбавлении 1% козьей сыворотки в PBS за 1 час.
5. Вымойте клетки три раза в течение 10 минут с 150 мМ NaCl, 25 мМ Трис, рН 7,6 с последующим добавлением люминесцентных меченых вторичных антител, таких, как Alexa Fluor-анти-488-кролика или Alexa Fluor--647 анти-мышиных антител вторичного разбавленный к 1: 1000 1% козьей сыворотки в PBS (заметим, что при зондировании для двух разных белков первичных антител должен быть поднят в различных видах и вторичных должны быть против соответствующего вида).
6. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа, мыть три раза TBS.
7. Посмотреть клеток в TBS буфера или другой подходящей среде просмотра.

4. Быстрый изображений кальция

1. Использование лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (например Fluoview 1000 Olympus).
2. Использование высокой числовой апертуре объектива.
3. Установите параметры измерения. Для кальция зеленый использование 488 нм возбуждение и длинный пас 515 фильтров излучения.
4. Отрегулируйте пикселей времени - для быстрого измерения кальция установите значение в 2 мкс / пиксель.
5. Установить изображению для достижения размер пикселя 0,05 - 0,3 мкм.
6. Выберите линию от ячейки выбор в конкретном регионе.
7. В окне контроллер раз выберите время приобретения, по крайней мере 1500 сканирований (чтобы получить желаемый сроковответа - 1,3 мс / линия даст 2 секунды).
8. Запись фоне чтения до стимуляции.
9. Стимулируйте клетки с 5 карбахола мкМ и сразу же начать запись данных. Держите клеток в 1 мл Leibovitz15 среды, подготовить 10 мкМ карбахола в Leibovitz15 и добавьте 1 мл осторожно на блюдо

5. Анализ данных

1. Извлечение интенсивности для каждого пикселя из записанных изображений. Сохранить интенсивность данных таблицы, используя Fluoview 1000 программное обеспечение.
2. Импорт данных в интенсивности SigmaPlot или аналогичный анализ данных программы и бен данных в ~ 9-40 баков. По сравнению с контрольными опытами и электронных шумов.

6. Представитель Результаты:

Мы отображаемого клеток на лазерной сканирующей конфокальной микроскопии LSM510 (Zeiss, Jena, Германия), оснащенных мульти-линии лазерного возбуждения и 40x/1.2 Н. А. апохромат погружения в воду цели. На рис. 1 (красный) мы покажем, distributioп кавеол в собачьей взрослых кардиомиоцитов желудочка, которые были исправлены и окрашивали антителами к кавеолина-3, который является основным структурным caveolar белка в этих клетках ^9. Кавеолина-3 был immunolabelled с Alexa-647 и возбужденных с 633-нм линию от He: Ne лазер. Изображения были записаны с помощью LP650 нм излучения фильтром. Распределение кавеолина-3 был по сравнению с Gα _д, который был immunolabeled с Alexa-488 (зеленый). Alexa-488 Возбуждение 488nm Аргон-ионный лазерной линии и изображения был записан с использованием BP505-530nm выбросов фильтр. В этих колокализации измерений, два флуорофоров возбуждались в последовательном порядке с использованием мульти приобретение Track. Эта процедура минимизирует канал перекрестных помех. Анализ данных для колокализации проводили с помощью AIM Программное обеспечение, прилагаемое Zeiss LSM510-Мета. Как видно, две белки colocalized.

Чтобы определить, как связь между кавеолина-3 и Gα 2 + Грин. Мы возбудили красителя с 488nm аргоновый ионный лазер и собирали изображения через LP515 выбросов фильтр. Изображение кадры были собраны в 500 мс интервалы. Интенсивность значения для каждого пикселя были извлечены при помощи Olympus программного обеспечения и ImageJ. Строка режима сканирования была использована для количественного анализа быстрее Са ^{2 +} переходных процессов и Са ^{2 +} искр. Размер пикселя, используемые в настоящем исследовании был 0,1-0,3 мкм. Линейный скорость сканирования составила около нескольких сотен мкс в строке. На рис. 2 показаны линии сканирования от Са ^{2 +} Green-загружалась кардиомиоцитов, где пиксель га время было 2 мкс, линии времени 142 мкс. Изображение состоит из 1200 строк.

Каждая строка сканирования соответствует интенсивности колебания Са ^{2 +} зеленый, состоящий из 71 точки берется по 142 мкс диапазоне, и может быть использован в качестве быстрого считывания кальция ответов. Например, на рис. 3 мы покажем, Ca ^{2 +} активность одной строки отдельных кардиомиоцитов, измеряемый Са ^{2 +} Зеленый интенсивности флуоресценции как функция времени в секундах до (вверху) и после (внизу) добавлением 5 мкМ карбахола что повышает уровня внутриклеточного Са ^{2 +} через Gα _д-PLCβ деятельности. Когда многие линии усредняются, карбахола стимуляция производит ~ 1,8 кратное увеличение Са ^{2 +} Зеленый интенсивности. В связи с изменениями в экспериментальных условиях (комнатная температура, мощность лазера, отклик детектора, краситель распределения и т.д.), это увеличение не может рассматриваться в отдельныхлинии сканирования. Хотя интенсивность значения (значения у оси) подобны, то ясно, что карбахола-стимулированных участка, на дно гораздо более широкие пики, соответствующие более устойчивый уровень кальция, чем узкие пики колебание видел стимуляции. Это расширение и относительный рост интенсивности скрывает небольшие, более медленным колебаниям. Нашей целью является лучше различать между этими разными типами очевидным кальция колебаний.

Другой пример из этих быстрых флуктуации кальций показан на рис. 4. Верхний график показывает исходные данные линии вынужденного желудочков кардиомиоциты (красный) и в среднем на 3 следы линия черным цветом. Для определения степени, что эти колебания кальция были опосредованы Gα _д - caveoline3 взаимодействий, мы microinjected пептид, который дестабилизирует кавеолина-3 - Gα _д взаимодействий (т.е. Cav3 пептид), который устраняет больше Са ^{2 +} ток, и эти данные показаны синим цветом(Заметим, что мы вычли 500 от Cav3 пептид интенсивности, так что два следа может быть лучше разглядеть).

Мы импортировали столбцов исходных данных от наших Excel файлов в SigmaPlot (Jandel, Inc) и проводится анализ гистограммы. В этом анализе, число событий сгруппированы в равном количестве коробок (бункеры) для получения гистограммы. Ширина бен представляет равный промежуток времени. Интенсивности вставляются в разное время связывает так, чтобы высота частности бен представляет, сколько раз интенсивность происходит в конкретное окно времени. Так как этот тип анализа, зависит только от сбора данных с той же скоростью сканирования, многие следы могут быть проанализированы одновременно. Кроме того, этот анализ не чувствительны к различиям в уровнях красителя, мощность лазера и т.д., а также электронные и фонового шума происходит на временных масштабах очень быстро, и это можно увидеть только в первые 1-2 бункеров.

Соответствующие histograмс исходных данных на рис. 4 показаны в нижней части страницы. Гистограммы для контрольных клеток расположены на большом количестве бункеров соответствующее время широкое распространение, о чем свидетельствуют красная линия (линия для направления глаза и ни одна модель предполагается). В отличие от бункеров для ответа клеток, где Gα _д-Cav3 взаимодействия была нарушена пептид приурочены к узким распределением бен предположить, что наличие пептидных устраняет больше потоков продолжительности. Микроинъекции контроль пептид, который не нарушает Gα _д-Cav3 производит Гистограмма похожа на ООН-клетки вводили ^8.

На рис. 5 сравнить быстрые колебания интенсивности Са ^{2 +} Зеленый во взрослой собачьей кардиомиоцитов желудочка (слева) и свежий, нестимулированных крысы новорожденных кардиомиоцитов, что отсутствие кавеол (справа). Здесь, соответствующие гистограммы интенсивности в течение 3-минутный период были binned на 35, чтобы посмотреть медленнее событий кальция. Обратите внимание, что новорожденных кардиомиоцитов отображения быстрых флуктуации на плоской базовой показывающие отсутствие медленных Са ^{2 +} активность в то время как более структурированные базовые видна для взрослых клеток. Эти различия наиболее легко увидеть в гистограммах.

Рисунок 1. Изображения собак взрослых кардиомиоцитов желудочка, показывающие распределение Gα _д immunolabeled с Alexa-488, где Alexa-488 Возбуждение 488nm аргон-ионный лазер линии и изображения был записан с использованием BP505-530nm выбросов фильтр. Вверху справа такое же качество просмотра фотографий локализации кавеолина-3 immunolabeled с Alexa-647, возбужденное с 633-нм линию от: Ne лазера и записаны с помощью LP650 нм излучения фильтром. Объединены изображения, где колокализации видится в оранжевый в левом нижнем углу с расширенным изображение справа.

"Pdflinebreak">

Рисунок 2. Кальций изображений собачьей жизни кардиомиоцитов желудочка взрослых загружается с Са ^{2 +} Грин. Снимок был сделан на конфокальной лазерной системы сканирующий микроскоп с 40х цель использования 488nm аргонового ионного лазера и LP515 выбросов фильтр. Изображение состоит из 1200 строк, пикселей время задержки составило 2 мкс, а размер пикселя составляет 0,1 мкм.

Рисунок 3. TOP колебания интенсивности линии следа от жизни собачьей кардиомиоцитов желудочка взрослых загружается с Са ^{2 +} зеленый и отображаемого как описано, и нижней же клетке стимулируется добавлением 5 карбахола мкМ.

/ 3505fig4.jpg "/>
Рисунок 4. TOP пример линии следов от жизни собачьей кардиомиоцитов желудочка взрослых загружается с Са ^{2 +} Зеленый (красный) принято более 180 мс, где в среднем на 3 следы отображается как черная линия, и по сравнению с ячейки, которая была microinjected с пептид, который нарушает Gα _{д-кавеолина} 3 ассоциации (красный), где средний из трех следов в черный цвет. Отметим, что мы вычли 400 подсчитывает интенсивности от нижней набор данных для просмотра целей. Нижней панели соответствующие гистограммы binned данных, как описано в тексте, и где бен число произвольно и бен кол-во (или просто в счет) соответствует общей сумме интенсивности в частности, что мусорное ведро. Отметим, что линия красная и синяя линии, проведенные в контроле (слева) и пептид (справа) гистограммы для упрощения идентификации и сравнения данных и ни одна модель предполагается.

files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Интенсивность колебаний ионов Са ^{2 +} Зеленый во взрослой собачьей кардиомиоцитов желудочка (слева) и свежий, нестимулированных крысы новорожденных кардиомиоцитов, что отсутствие кавеол (справа) и соответствующие им гистограммы приведены ниже.

Discussion

Мы разработали метод для просмотра и быстрой изоляции сигналов кальция в живых кардиомиоцитов. Хотя экспериментальные условия этих измерений были ранее применены к другим системам ячейки ^10, а также кардиомиоцитов ^11, использование гистограмм и бен анализа позволяет использовать данные из многих Са ^{2 +} мероприятий, которые будут приобретены. Быстрее события могут быть легко изолирован от более медленные и моделей, адаптированных понять лежащие в их основе механизмов. Культивирование кардиомиоцитов, так как многие первичные клеточные линии, может быть затруднено. Хотя, по общему мнению, что измерения должны быть проведены вскоре после того, клетки приобрели, мы обнаружили, что взрослые собачьей кардиомиоцитов мы использовали в этом исследовании только начинают терять свои специфические свойства через 3 дня. Это более длительный период времени позволяет клеткам прочно прикрепить к подложке гарантируя, что клетки выживут потенциально смертельной процедуры, такие как микроинъекции. Фирма вложений является критическимдля успеха микроинъекции.

Мы проверили роль Gα _{д-кавеолина} 3 ассоциации кальцием потоков по microinjecting пептид, который нарушает их взаимодействие. Мы хотели бы подчеркнуть, что микроинъекции должно быть сделано с большой осторожностью, чтобы свести к минимуму повреждения клеток и клеточных утечки содержимого. Тем не менее, эти риски должны быть сбалансированы за счет использования большего диаметра иглы, которые необходимы для доставки достаточного количества материала в относительно больших кардиомиоцитов. Включение красителя, таких как DAPI, что позволяет отслеживать, какие клетки были микроинъекции имеет важное значение. Как уже говорилось, важно, что для микроинъекции миоцитов купаются в среде без кальция и что решения вводят также является бесплатным кальция. Приток внеклеточного кальция инициирует сокращения и последующей гибели клеток

Сами измерения могут быть адаптированы к другим типам клеток, красители и конфокальной лазернойСистемы следовать за другими событиями быстрого клеток, таких как insoitol 1,4,5 trisphospate и цАМФ потоков, хотя и Са ^{2 +} потоки, безусловно, один самых сложных клеточных посредников. Следует быть осторожными с выбором флуоресцентных индикаторов, которые не так легко photobleached и надежная и динамичная флуоресценции ответ так, чтобы лазер малой мощности могут быть использованы. Низкая мощность лазера будет также избежать локального нагрева, которые могут привести к нежелательным клеточные эффекты.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234