Bepaling van de lipid raft van afscherming van fluorescent-gelabelde probes in levende cellen met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie (FCS)
Summary
Een techniek om de lipid raft verdeling van fluorescerende eiwitten in de plasmamembraan van levende cellen sonde wordt beschreven. Het maakt gebruik van de verschillen in verspreiding tijden van eiwitten die gelegen zijn binnen of buiten van lipide rafts. Overname kan dynamisch worden uitgevoerd in controle omstandigheden of na drugsverslaving.
Abstract
In de afgelopen vijftien jaar het idee dat de celmembranen niet homogeen zijn en vertrouwen op microdomeinen om hun taken uit te oefenen is op grote schaal geaccepteerd. Lipid rafts zijn membraan microdomeinen verrijkt in cholesterol en sfingolipiden. Ze spelen een rol in de cellulaire fysiologische processen, zoals het signaleren, en de handel 1,2, maar wordt ook gedacht dat de belangrijkste spelers in een aantal ziekten, waaronder virale of bacteriële infecties en neurodegeneratieve ziekten 3.
Maar hun bestaan is nog steeds onderwerp van controverse 4,5. Inderdaad, lipid raft grootte van naar schatting rond de 20 nm 6 te zijn, ver onder de resolutie limiet van conventionele microscopie (ongeveer 200 nm), waardoor zich verzet tegen hun directe beeldvorming. Tot nu toe de belangrijkste technieken gebruikt om de verdeling van eiwitten van belang in lipid rafts te beoordelen waren reinigingsmiddelenbestendige Membranen (DRM's) isolatie en co-patching met antilichamen. Hoewel gebruikte becahet gebruik van hun vrij makkelijk de uitvoering, deze technieken waren gevoelig voor artefacten en dus kritiek op 7,8. Technische verbeteringen waren daarom noodzakelijk om deze artefacten te overwinnen en om te kunnen lipid rafts partitie sonde in levende cellen.
Hier presenteren we een methode voor de gevoelige analyse van lipide rafts verdeling van fluorescent-gemerkte eiwitten of lipiden in het plasmamembraan van levende cellen. Deze methode genoemd Fluorescentie Correlatie Spectroscopie (FCS), gebaseerd op het verschil in diffusie tijden fluorescerende probes binnen of buiten rafts. In feite, zoals blijkt uit zowel kunstmatige membranen en celculturen, zou probes verspreiden veel sneller buiten dan binnen dichte lipid rafts 9,10. Diffusie tijd te bepalen, worden minuten fluorescentie schommelingen gemeten als functie van de tijd in een knooppunt (ongeveer 1 femtoliter), gelegen aan de plasmamembraan van cellen met een confocale microscoop (Fig.1). De auto-correlatie curves kan vervolgens worden getrokken uit deze schommelingen en met de juiste wiskundige diffusiemodellen 11.
FCS kan worden aan de lipide vlot verdeling van verschillende probes, zolang zij fluorescent gelabeld bepalen. Fluorescerende labels kan worden bereikt door de expressie van fluorescerende fusie-eiwitten of door binding van fluorescerende liganden. Bovendien kan FCS niet alleen worden gebruikt in kunstmatige membranen en cellijnen, maar ook in primaire kweken zoals beschreven onlangs 12. Het kan ook worden gebruikt om de dynamiek van lipide vlot afscherming volgen verslavingen membraan lipiden verandering 12.
Protocol
Discussion
De FCS hier gepresenteerde methode zorgt voor een gevoelige en snelle analyse van de lipid raft verdeling van fluorescerende probes van belang in levende cellen. FCS combineert de nauwkeurigheid van de lokalisatie van confocale microscopie met de gevoeligheid van single photon tellen. Het belangrijkste verschil tussen FCS en standaard technieken is dat biochemische FCS de absolute bepaling van de rafts verdeling van het doel en niet de relatieve verdeling kan zoals het geval is DRM isolatie of co-patching.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van Agence Nationale de la Recherche (Choad). We zijn ook dankbaar voor de Fondation ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) voor hun financiële steun.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Cholera toxin subunit B-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | MW (pentamer) = 57 kg/mol |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Incubator for temperature and CO2 control | Life imaging services | The Cube and the Box | |
| SPAD (Single Photon Avalanche Diode) | MPD (Micro Photon Devices) | PDM serie (100 μm sensitive area) | |
| High pass 488 nm filter | Semrock | 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25 |
|
| FCS detection unit | Picoquant | Picoharp 300 module | |
| Acquisition and auto-correlation software | Picoquant | SymPhoTime | |
| Fitting software | OriginLab | OriginPro8 |
References
- Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Gerl, M. J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).
- Simons, K., Ehehalt, R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).
- Munro, S. Lipid rafts: elusive or illusive. Cell. , 115-377 (2003).
- Shaw, A. S. Lipid rafts: now you see them, now you don’t. Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).
- Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).
- Brown, D. A., London, E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).
- Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).
- Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes. Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).
- Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in living cells. Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).
- Marquer, C. Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).
- Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications. Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).
- Ilien, B. Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process. J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).
- Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).
- Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy. Biophys. J. 33, 435-454 (1981).
- Thompson, N. L., Steele, B. L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).
- Eggeling, C. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457, 1159-1162 (2009).
- Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).
- Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts. J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).
- White, R. Holin triggering in real time. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).
- Digman, M. A. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).
- Digman, M. A. Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure. Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).
- Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells. Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys. J. 92, 613-621 (2007).
- Bates, I. R. Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones. Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).
