Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

लिपिड बेड़ा का दृढ़ संकल्प प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCS) के द्वारा जीवित कोशिकाओं में जांच fluorescently टैग की विभाजन

doi: 10.3791/3513 Published: April 6, 2012

Summary

एक जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में फ्लोरोसेंट प्रोटीन लिपिड बेड़ा विभाजन जांच तकनीक वर्णित है. यह अंदर या के बाहर लिपिड rafts स्थित प्रोटीन का प्रसार बार में असमानता का लाभ लेता है. नियंत्रण की स्थिति में या दवा के बाद इसके अलावा अधिग्रहण गतिशील प्रदर्शन किया जा सकता है.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. FCS सेटअप के अंशांकन

  1. Confocal सूक्ष्मदर्शी, लेज़रों, कंप्यूटर, तापमान के लिए इनक्यूबेटर और सीओ 2 नियंत्रण शुरू करो.
  2. सुनिश्चित करें कि SPAD (एक फोटान हिमस्खलन डायोड) पर है और SPAD अंदर प्रतिदीप्ति फिल्टर अच्छी तरह से अपने नमूने के अनुकूल है. जाँच करें कि SPAD समय में लयबद्ध है. केवल अपने FCS सॉफ्टवेयर शुरू एक बार अपने SPAD सेटिंग्स अधिग्रहण के लिए तैयार कर रहे हैं खबरदार.
  3. हैजा विष - Alexa488 के एक ताजा पीबीएस में पतला समाधान 1 μg / मिलीलीटर (17.5 एनएम) के एक एकाग्रता तक पहुँचने तैयार.
  4. माइक्रोस्कोप के आंतरिक पता लगाने का उपयोग कर समाधान के confocal इमेजिंग का अनुकूलन.
  5. स्कैनिंग मोड बिंदु और समाधान के नमूने में एक बिंदु का चयन स्विच. सुनिश्चित करें कि लेजर रोशनी की अवधि के लंबे समय के लिए अपने एफसीएस अधिग्रहण करने के लिए पर्याप्त (> 5 मिनट) है.
  6. SPAD द्वारा बाह्य पता लगाने के लिए और एफसीएस सॉफ्टवेयर करने के लिए स्विच. अपने प्रतिदीप्ति संकेत मॉनिटर और सुनिश्चित करें कि यह अच्छी तरह से है सुईSPAD के लिए टेड (पर्याप्त संकेत लेकिन कोई संतृप्ति, 10 50 000 की गिनती के लिए 000 / ठीक है). यदि आवश्यक हो, Z स्थिति, लाभ और / या लेजर सही प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त करने की शक्ति को संशोधित.
  7. 30 सेकंड के माप के 10 सेट मोल. अधिग्रहण के समय अपने नमूना के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए (सबसे अच्छा नमूना और photobleaching समस्याओं के बीच समझौता).
  8. आपके डेटा (चरण 4 देखें) करने के लिए सुनिश्चित करें कि आप एक ऑटो सहसंबंध एक फ्लोरोसेंट समाधान में diffusing के प्रजातियों के लिए इसी वक्र (2 चित्र में समीकरण) है कि प्रसार समय फिटिंग बाद प्राप्त सही है (0.2 लगभग एमएस) (चित्र का विश्लेषण 3.).

2. लिपिड Rafts मार्कर के साथ जीवित कोशिकाओं का धुंधला हो जाना

  1. प्लेट 8 अच्छी तरह से (1mg/ml) इमेजिंग दिन पहले लगता है कि उनके आसंजन सही है पाली एल lysine के साथ लेपित Labteks पर HEK293 कोशिकाओं. फिनोल करने के लिए सुनिश्चित करें प्रतिदीप्ति संकेत का कोई गड़बड़ी है लाल के बिना मध्यम का प्रयोग करें.
  2. HbSS (हांक बफर नमक समाधान) के साथ कोशिकाओं को दो बार धो.
  3. 500 μl HbSS में विष Alexa488 हैजा (1 μg / एमएल) / BSA (0,1%) 37 पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं में जोड़ें डिग्री सेल्सियस हैजा विष ganglioside GM1, preferentially लिपिड rafts में विभाजित किया जाना करने के लिए बाध्य होगा.
  4. HbSS (हांक बफर नमक समाधान) के साथ कोशिकाओं को दो बार धो.

3. जीवित कोशिकाओं पर एफसीएस डाटा अधिग्रहण

  1. खुर्दबीन मंच पर दाग कोशिकाओं रखें. यकीन है कि तापमान और सीओ 2 शर्तों अन्यथा इष्टतम के इस प्रसार बार में कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
  2. खुर्दबीन छवि (4) के आंतरिक पता लगाने का उपयोग ब्याज की एक सेल confocal इमेजिंग का अनुकूलन.
  3. स्कैनिंग मोड इंगित करें और ब्याज की कोशिका के प्लाज्मा झिल्ली में एक बिंदु का चयन करने के लिए स्विच. सुनिश्चित करें कि सेल अधिग्रहण के दौरान नहीं बढ़ रहा है बनाने के लिए सेल के 1-2 रहते छवियों का प्रदर्शन करते हैं.
  4. SPAD द्वारा बाह्य पता लगाने के लिए स्विच और एफसीएस नरम करने के लिएबर्तन. अपने प्रतिदीप्ति संकेत मॉनिटर और यकीन है कि यह अच्छी तरह से SPAD के लिए अनुकूल है (पर्याप्त संकेत लेकिन कोई संतृप्ति, 10 000 50 000 मायने रखता है / ठीक है). यदि आवश्यक हो, Z स्थिति, लाभ और / या लेजर सही प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त करने की शक्ति को संशोधित. यदि यह पर्याप्त नहीं है, आप धुंधला शर्तों को बदलने पर विचार कर सकते हैं.
  5. 30 सेकंड के माप के 10 नमूनों का मोल. के रूप में सबसे अधिक कोशिकाओं ऑटो फ्लोरोसेंट हैं, तो आप पहले अधिग्रहण के दौरान प्रतिदीप्ति में कमी, ऑटो प्रतिदीप्ति लुप्त होती के लिए कारण सकता है.

4. एफसीएस डेटा विश्लेषण

  1. सहसंबंध अंतराल सेट और ऑटो सहसंबंध FCS सॉफ्टवेयर के साथ घटता उत्पन्न. सहसंबंध अंतराल आमतौर पर कम से कम रिजॉल्वेबल अंतराल समय से लंबे समय तक संभव समय (माप के आँकड़े के रूप में अधिक से अधिक अपर्याप्त है जब अधिकतम सहसंबंध समय कुल अधिग्रहण के समय दृष्टिकोण बन जाता है, अधिकतम समय अंतराल के 80% तक सीमित है के लिए लेकर जाएगा अधिग्रहण के समय पर PicoquaNT) सॉफ्टवेयर.
  2. प्रत्येक नमूना के लिए, प्रतिदीप्ति और समय के एक समारोह के रूप में ऑटो सहसंबंध उतार चढ़ाव के संगत फ़ाइलों को निर्यात.
  3. डेटा विश्लेषण और फ़ाइलें आयात प्रो उत्पत्ति जैसे फिटिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.
  4. प्रत्येक नमूना के लिए, सुनिश्चित करें कि अधिग्रहण के दौरान कोई photobleaching है यानी प्रतिदीप्ति 30 सेकंड के दौरान स्थिर रहता है. त्यागें किसी भी उपाय प्रदर्शित photobleaching के रूप में इस कृत्रिम अब प्रसार बार का कारण हो सकता है.
  5. जाँच करें कि शेष है FCS घटता का आकार सही है (चित्र 5). निर्धारित मतलब एफसीएस वक्र.
  6. उचित गणितीय मॉडल (छवि 2) के साथ वक्र फिट बैठते हैं. यह फिट आप प्रसार (एस) और (ese) प्रसार समय (ओं) के साथ diffusing के अणुओं के अनुपात दे देंगे.

5. प्रतिनिधि परिणाम

एक हैजा समाधान विष Alexa488 के साथ FCS अंशांकन का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया जाता है (चित्रा 3A) photobleaching, व्यक्ति नहीं दिखा था और एफसीएस घटता मतलब करने के बाद गणना की गई. मीन एफसीएस घटता विभिन्न प्रसार मॉडल (चित्रा 2 में उदाहरण) करने के लिए इसी समीकरण के साथ लगे थे. प्रतिष्ठित माना एक फिट की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए पैरामीटर 2 आर दृढ़ संकल्प के गुणांक है. करीब आर 2 1 करने के लिए है, बेहतर फिट है. इस मामले में, सबसे सटीक मॉडल मतलब है FCS वक्र फिट फ्लोरोसेंट diffusing के अणुओं की आबादी तीन आयाम (चित्रा 2 और चित्रा 3B में 1 समीकरण) में स्वतंत्र रूप से वर्णन है. प्रसार फिट से व्युत्पन्न समय 0.32 MS है. (चित्रा 3C) वक्र ढाले और आर 2 कारक (0.९९९०६) के से बच फिट की गुणवत्ता के एक अनुमान दे.

हैजा विष Alexa488 HEK2 दाग के लिए FCS विश्लेषण का एक उदाहरण93 कोशिकाओं चित्रा 5 में दिखाया गया है. multiphasic मतलब FCS वक्र आकार अलग प्रसार बार के साथ फ्लोरोसेंट अणु की आबादी के अस्तित्व का पता चलता है. एक रुकावट झिल्ली विमान में दो आयामों में प्रसार प्रसार और तीन आयामों में आज़ादी से diffusing के एक (चित्रा 2 और चित्रा 5 में 2 समीकरण) के साथ दो: इस वक्र के लिए सबसे अच्छा फिट तीन फ्लोरोसेंट जांच की आबादी के साथ एक मॉडल से मेल खाती है . यह बाद की आबादी फ्लोरोसेंट अणुओं झिल्ली विमान, यानी, या तो बाध्यकारी या उनके झिल्ली लक्ष्य को unbinding के बाहर जाने से मेल खाती है, स्राव या रीसाइक्लिंग मार्ग के माध्यम से झिल्ली तक पहुँचने, या endocytosis द्वारा झिल्ली छोड़ने. झिल्ली में दो प्रसार बार, हैजा विष GM1 करने के लिए बाध्य करने के लिए इसी, 2 एमएस (अणुओं की 25%), लिपिड rafts का बाहर प्रसार करने के लिए संगत, और 75 (अणुओं की 50%) एमएस, लिपिड rafts में प्रसार करने के लिए इसी . कृपया ध्यान दें कि किसी भी photobleachअधिग्रहण के दौरान आईएनजी कृत्रिम अब प्रसार बार इस प्रकार संभवतः GM1 की लिपिड बेड़ा डोमेन में स्थानीयकरण की दिशा में एक पूर्वाग्रह बनाने के लिए नेतृत्व करेंगे.

चित्रा 1
चित्रा 1 सेट अप (चित्र Marquer एट अल से संशोधित 12.) एफसीएस की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व.

चित्रा 2
चित्रा 2 प्रसार मॉडल और इसी समीकरण लिए autocorrelation घटता फिट करने के लिए प्रयोग किया जाता का उदाहरण है. 1 / ई 2 तीव्रता और w0 प्रभावी ला में ऑप्टिकल अक्ष के साथ संरचना पैरामीटर एस एस = z / 0 डब्ल्यू 0 0 z साथ प्रभावी केन्द्र त्रिज्या के रूप में लिखा जा सकता है1 / ई 2 तीव्रता के पर teral केन्द्र त्रिज्या. इन मूल्यों को एक शास्त्रीय बात फैल समारोह माप (पीएसएफ) से निकाला जा सकता है.

चित्रा 3
चित्रा 3 हैजा समाधान में विष Alexa488 के एफसीएस अंशांकन के लिए प्रसार समय का आकलन. एक 30 सेकंड के अधिग्रहण के एक प्रतिनिधि उदाहरण के लिए समय के एक समारोह के रूप में) एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता. बी) autocorrelation 30 सेकंड 1 समीकरण के साथ फिट अधिग्रहण के 10 नमूने (चित्र 2 देखें) सी.) वक्र ढाले से बच से प्राप्त वक्र मतलब.

चित्रा 4
चित्रा 4. HEK 293 सेल हैजा विष - Alexa488 साथ दाग. कोशिकाओं आंतरिक 488nm लेजर लाइन के साथ एक SP5 confocal सूक्ष्मदर्शी (Leica माइक्रोसिस्टम्स, Wetzlar, जर्मनी) के imaged थे. प्रतिदीप्ति एक X60 योजना के APOCHROMAT तेल विसर्जन के उद्देश्य के साथ 500 के बीच एकत्र किया गया थाऔर 650 एनएम.

चित्रा 5
चित्रा 5 हैजा विष Alexa488 की प्रसार समय के आकलन HEK293 कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में. ए) autocorrelation 2 समीकरण के साथ फिट वक्र (चित्र 2 देखें) का मतलब. बी वक्र ढाले से बच गया). (Marquer एट अल से संशोधित 12.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

एफसीएस विधि यहाँ प्रस्तुत जीवित कोशिकाओं में ब्याज की जांच फ्लोरोसेंट के लिपिड बेड़ा विभाजन की एक संवेदनशील और तेजी से विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है. एफसीएस फोटान गिनती की संवेदनशीलता के साथ confocal माइक्रोस्कोपी का स्थानीयकरण की सटीकता को जोड़ती है. एफसीएस और मानक जैव रासायनिक तकनीकों के बीच मुख्य अंतर यह है कि FCS लक्ष्य की लिपिड rafts के विभाजन और रिश्तेदार नहीं विभाजन के लिए सक्षम बनाता है पूर्ण दृढ़ संकल्प के रूप में DRMS ​​अलगाव या सह पट्टी के लिए मामला है.

एफसीएस डेटा का अधिग्रहण प्रत्येक नमूना के लिए (लगभग 5 मिनट 30 सेकंड 10 अधिग्रहण) लेता है और इस प्रकार काफी तेजी के रूप में हमेशा की तरह जैव रासायनिक तकनीक की तुलना में. इस तेज़ी के समय में लिपिड बेड़ा विभाजन में बेचैनी है कि नशीली दवाओं के अलावा से परिणाम हो सकता है का पालन करने के लिए संभव बनाता है. हालांकि, autocorrelation घटता विश्लेषण थोड़ा मुश्किल हो के रूप में फिटिंग के लिए विभिन्न मॉडलों के माध्यम से browsed किया जा करने के लिए निर्धारित हो सकता हैसबसे सटीक. इसके अलावा, अधिग्रहण के दौरान photobleaching के रूप में इस कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते से परहेज किया जाना है.

Ganglioside GM1 छवि (5): हम यहाँ एक उदाहरण है जहाँ हम लिपिड लिपिड का विभाजन बेड़ा चित्रित करना कर सकते हैं का वर्णन. इस तरह के एक अध्ययन मानक जैव रासायनिक प्रक्रिया है जो केवल प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है के साथ संभव नहीं होता है. एफसीएस हालांकि लिपिड के लिए सीमित नहीं है और भी प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या तो एक फ्लोरोसेंट (जैसे transferrin-Alexa555 transferrin रिसेप्टर, 9 rafts का बाहर स्थित हो जाना करने के लिए बांधता है) या एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ एक संलयन के रूप में व्यक्त ligand के साथ टैग (जैसे एपीपी YFP या 9 Bace1 - GFP, अल्जाइमर रोग में दो महत्वपूर्ण प्रोटीन खिलाड़ियों). यह इस प्रकार लक्ष्यों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, एफसीएस सेल लाइनों में न केवल लागू कर सकते हैं, के रूप में यहाँ वर्णित है, लेकिन भी प्राथमिक 9 संस्कृतियों में.

हैजा विष के संबंध में, आप ध्यान में रखना चाहिएकि यह pentamers में कुल GM1 के लिए एक प्रवृत्ति है, इस प्रकार सूक्ष्म डोमेन कि देशी लिपिड rafts से अलग हो सकता है झिल्ली बनाने. यही कारण है कि तुम क्यों हैजा विष के साथ colocalisation का उपयोग नहीं कर अगर ब्याज की अपने प्रोटीन के अंदर या बाहर rafts का निर्धारित करने के लिए कर सकते हैं. फिर भी, एपीपी YFP और Bace1 - GFP के रूप में झिल्ली प्रोटीन, 60-80 की प्रसार बार 9 MS, हैजा विष (75 एमएस) के साथ मनाया गया था समान के साथ लिपिड rafts में फैलाना है. इस प्रकार हैजा विष आपके सेट अप जांचना और जाँच लें कि आप तेजी से और धीमी गति से प्रसार के समय के बीच अंतर कर सकते हैं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

एफसीएस भी एक प्रोटीन 15 या / ligand रिसेप्टर औषधीय 16 अध्ययन के oligomerisation राज्य के दृढ़ संकल्प के रूप में कई अन्य 13,14 अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल है. यह भी कुल आंतरिक परावर्तन (TIRF) प्रतिदीप्ति 17,18 या प्रेरित उत्सर्जन रिक्तीकरण (STED) 19 के रूप में अन्य माइक्रोस्कोपी तकनीक करने के लिए युग्मित किया जा सकता है.दरअसल, STED के एफसीएस लिपिड बेड़ा की एक भी अधिक सही निर्धारण 19 विभाजन की अनुमति देता है लेकिन अब तक, STED के माइक्रोस्कोपी अभी भी महंगा है और बड़े पैमाने पर नहीं इस प्रकार है.

एफसीएस की मुख्य सीमा fluorophores की कम मात्रा nanomolar रेंज में और तेजी से प्रसार बार के लिए की जरूरत है ताकि fluorophores उत्तेजना मात्रा छोड़ने से पहले photobleach नहीं होगा. पूरक करने के लिए प्रोटीन के प्रसार का आकलन तकनीक (प्रतिदीप्ति वसूली के बाद Photobleaching) FRAP और आईसीएस (छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी) तकनीक (20 समीक्षा) शामिल हैं.

FRAP में, एक उच्च तीव्रता लेजर बीम और photobleaching तो नजर रखी है के बाद प्रतिदीप्ति की वसूली सेल की एक क्षेत्र photobleach के लिए प्रयोग किया जाता है. यह वसूली गैर प्रक्षालित क्षेत्रों के से प्रक्षालित क्षेत्र के fluorophores के प्रसार से आता है. इस प्रकार प्रसार बार वसूली कैनेटीक्स से निकाला जा सकता है. FRAP उच्च ओ सांद्रता के साथ इस्तेमाल किया जा सकता हैच fluorophores और प्रसार बार की बड़ी रेंज का उपयोग करने के लिए, इस प्रकार यह है FCS के लिए पूरक कर सकते हैं. FRAP का आकलन करने के लिए कि क्या एक में fluorophore majoritarily अंदर या 21,22 rafts के बाहर था इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह अभी भी एक नहीं बल्कि थोक विधि के हित के क्षेत्र में fluorophores diffusing के अंदर या बाहर rafts का अनुपात यों है.

आईसीएस है FCS, जिस में स्थानिक सहसंबंध एक दिया छवि के लिए 23 पिक्सेल द्वारा पिक्सेल गणना की है एक इमेजिंग अनुरूप है. यह धीरे diffusing के फ्लोरोसेंट जांच का अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी होने का फायदा है लेकिन 2D विश्लेषण करने के लिए सीमित है. इस सीमा आईसीएस के विकास से उबरने spatio-अस्थायी आईसीएस (stics) के 24 करार दिया गया था. Stics छवियों का एक ढेर पर spatio-अस्थायी फ्लोरोसेंट जांच के संबंध में सक्षम बनाता है और इस तरह एक शक्तिशाली तकनीक है, हालांकि यह कम्प्यूटेशनल कार्यान्वयन की एक बहुत आवश्यकता है और एफसीएस की तुलना में एक कम समय संकल्प है. वास्तव में, दोनों आईसीएस और stics बहुत धीमी वें प्रक्रिया के लिए सीमित कर रहे हैंएक छवि फ्रेम के अधिग्रहण के समय. आईसीएस की एक और विस्तार रेखापुंज आईसीएस (RICS) कहा जाता है 25,26 रेखापुंज स्कैन सबसे वाणिज्यिक confocal सूक्ष्मदर्शी पर उपलब्ध मोड का लाभ लेने के द्वारा तेजी से प्रसार की प्रक्रिया के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है. RICS बहुमुखी है के रूप में यह एक बड़ा प्रसार रेंज (एमएस के लिए μs से) लेकिन इसके कार्यान्वयन () पैरामीटर, डेटा प्रसंस्करण स्कैनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बोझिल हो सकता है. हम साहित्य आईसीएस और उसके व्युत्पन्न तकनीक का उपयोग लिपिड rafts के 27-29 अध्ययन की रिपोर्ट में कई कागजात नहीं मिला.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम Agence Nationale डे ला Recherche से (ChoAD) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. हम भी Fondation ICM (Institut डु Cerveau एट डी ला Moelle) के उनके वित्तीय समर्थन के लिए आभारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cholera toxin subunit B-Alexa 488 Invitrogen C-34775 MW (pentamer) = 57 kg/mol
Confocal microscope Leica Microsystems SP5
Incubator for temperature and CO2 control Life imaging services The Cube and the Box
SPAD (Single Photon Avalanche Diode) MPD (Micro Photon Devices) PDM serie (100 µm sensitive area)
High pass 488 nm filter Semrock 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25
FCS detection unit Picoquant Picoharp 300 module
Acquisition and auto-correlation software Picoquant SymPhoTime
Fitting software OriginLab OriginPro8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).
  2. Simons, K., Gerl, M. J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).
  3. Simons, K., Ehehalt, R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).
  4. Munro, S. Lipid rafts: elusive or illusive. Cell. 115-377 (2003).
  5. Shaw, A. S. Lipid rafts: now you see them, now you don't. Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).
  6. Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).
  7. Brown, D. A., London, E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).
  8. Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).
  9. Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
  10. Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes. Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).
  11. Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in living cells. Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).
  12. Marquer, C. Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).
  13. Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications. Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).
  14. Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).
  15. Ilien, B. Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process. J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).
  16. Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).
  17. Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy. Biophys. J. 33, 435-454 (1981).
  18. Thompson, N. L., Steele, B. L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).
  19. Eggeling, C. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457, 1159-1162 (2009).
  20. Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).
  21. Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts. J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).
  22. White, R. Holin triggering in real time. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).
  23. Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).
  24. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).
  25. Digman, M. A. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).
  26. Digman, M. A. Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure. Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).
  27. Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells. Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).
  28. Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys. J. 92, 613-621 (2007).
  29. Bates, I. R. Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones. Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).
लिपिड बेड़ा का दृढ़ संकल्प प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCS) के द्वारा जीवित कोशिकाओं में जांच fluorescently टैग की विभाजन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marquer, C., Lévêque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J. Vis. Exp. (62), e3513, doi:10.3791/3513 (2012).More

Marquer, C., Lévêque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J. Vis. Exp. (62), e3513, doi:10.3791/3513 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter