生きた細胞の原形質膜における蛍光タンパク質の脂質ラフトのパーティショニングを調べるための手法が説明されています。これは、脂質ラフトの内側または外側に位置するタンパク質の拡散時間に格差を利用しています。買収は、コントロール条件でまたは薬物を添加した後、動的に実行することができます。
過去15年間で、細胞膜が均一ではありませんし、その機能を発揮するマイクロドメインに依存している概念は広く受け入れられるようになっています。脂質ラフトは、コレステロールとスフィンゴ脂質に富んだ細胞膜マイクロドメインである。彼らはこのようなシグナル伝達などの細胞生理学的プロセスにおいて役割を果たしており、人身売買の1,2だけでなく、ウイルスや細菌感染症や神経変性疾患の3を含むいくつかの疾患の主要なプレーヤーであると考えられている。
まだ彼らの存在は依然として論争4,5の問題です。確かに、脂質ラフトの大きさは、このように彼らのダイレクトイメージングを排除し、はるかに、従来の顕微鏡の分解能の限界(200 nm付近)の下で、約20 nmの6であると推定されている。現在までに、脂質ラフト内の目的タンパク質のパーティションを評価するために使用される主な技術は、界面活性剤耐性膜(ラフト)抗体を用いた分離と共同パッチでした。でも広く使われているbeca彼らは、むしろ簡単な実装を使用して、これらの技術は工芸品に傾向があったので、7,8を批判した 。技術的な改良は、したがって、これらの工芸品を克服し、生きた細胞における脂質ラフトのパーティションを調べることができるように必要であった。
ここでは、生きた細胞の細胞膜に蛍光タグタンパク質や脂質の脂質ラフトパーティションの高感度分析手法を提案する。このメソッドは、蛍光相関分光法(FCS)と呼ばれる、脂質ラフトの内側または外側に位置する蛍光プローブの拡散時間の格差に依存しています。実際には、人工膜や細胞培養の両方で明らかなように、プローブは、はるかに高速外緻密な脂質ラフト9,10の内側よりも拡散するだろう。拡散時間を決定するために、分蛍光変動がある( 図共焦点顕微鏡で細胞の細胞膜に位置し、焦点体積(約1フェムトリットル)内の時間の関数として測定される1)。自己相関曲線は、これらの変動から引き出され、適切な数学的拡散モデル11に取り付けることができます。
FCSは、それらが蛍光標識されている限り、様々なプローブのパーティショニング脂質ラフトを決定するために使用することができます。蛍光タグは、蛍光融合蛋白質の発現によって、または蛍光リガンドの結合によって達成することができます。また、FCSは、最近12を説明したように、人工の膜と細胞株でも初代培養だけでなく使用することができます。また、薬剤の添加や膜脂質組成の変化12の後にパーティショニング脂質ラフトの動態を追跡するために使うことができます。
ここで紹介するFCS法は、生きた細胞への関心の蛍光プローブの分割脂質ラフトの高感度で迅速な分析を可能にします。 FCSは、単一光子計数の感度を持つ共焦点顕微鏡の局在化の精度を兼ね備えています。 FCS、標準的な生化学的手法の主な違いは、ラフトの分離又は共パッチの場合のようにFCSがターゲットの脂質ラフトのパーティションではなく、相対的なパーティションの絶対的な決定を?…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、AFP通信国立·デ·ラ·ルシェルシュ(ChoAD)からの助成金によってサポートされていました。我々はまた、財政支援のための財団ICM(研究所·デュ·CerveauらデラMoelle)に感謝しています。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Cholera toxin subunit B-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | MW (pentamer) = 57 kg/mol |
Confocal microscope | Leica | SP5 | |
Incubator for temperature and CO2 control | Life imaging services | The Cube and the Box | |
SPAD (Single Photon Avalanche Diode) | MPD (Micro Photon Devices) | PDM serie (100 μm sensitive area) | |
High pass 488 nm filter | Semrock | 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25 |
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FCS detection unit | Picoquant | Picoharp 300 module | |
Acquisition and auto-correlation software | Picoquant | SymPhoTime | |
Fitting software | OriginLab | OriginPro8 |