Bestemmelse av Lipid Raft Partisjonering av fluorescently-merkede prober i levende celler ved fluorescens korrelasjon spektroskopi (FCS)
Summary
En teknikk for å sondere lipid flåten partisjonering av fluorescerende proteiner på plasmamembranen av levende celler er beskrevet. Det tar nytte av misforhold i diffusjon tider med proteiner lokalisert innenfor eller utenfor lipid flåter. Oppkjøp kan utføres dynamisk i kontroll forhold eller etter narkotika tillegg.
Abstract
I de siste femten årene den oppfatningen at cellemembraner er ikke homogent og stole på microdomains å utøve sine funksjoner er blitt allment akseptert. Lipid flåter er membran microdomains anriket på kolesterol og sphingolipids. De spiller en rolle i cellulære fysiologiske prosesser som signalering og menneskehandel 1,2, men er også antatt å være sentrale aktører i flere sykdommer, inkludert virus-eller bakterieinfeksjoner og nevrodegenerative sykdommer 3.
Likevel deres eksistens er fortsatt et spørsmål om uenighet 4,5. Faktisk har lipid flåte størrelsen er anslått å være rundt 20 nm 6, langt under oppløsningen grensen av konvensjonell mikroskopi (rundt 200 NM), og dermed utelukker deres direkte avbildning. Inntil nå, var de viktigste teknikkene som brukes til å vurdere delingen av proteiner av interesse inne lipid flåter Vaskemiddel Resistente membraner (DRMS) isolasjon og co-patching med antistoffer. Selv om mye brukt becabruk av deres ganske enkel implementering, var disse teknikkene tilbøyelige til gjenstander og dermed kritisert 7,8. Tekniske forbedringer var derfor nødvendig å overvinne disse gjenstandene, og for å kunne undersøke lipid flåter partisjon i levende celler.
Her presenterer vi en metode for sensitiv analyse av lipid flåtene partisjon av fluorescently-merkede proteiner eller lipider i plasmamembranen av levende celler. Denne metoden kalles fluorescens korrelasjon spektroskopi (FCS), avhengig av ulikheten i diffusjon tider med fluorescerende prober plassert innsiden eller utsiden av lipid flåter. Faktisk, noe som gjenspeiles i både kunstig membraner og cellekulturer, ville sonder spre mye raskere ute enn inne tette lipid flåter 9,10. For å bestemme diffusjon ganger, er liten fluorescens svingninger målt som en funksjon av tid i en fokal volum (ca. 1 femtoliter), som ligger ved plasma membran av celler med en confocal mikroskop (Fig.1). De auto-korrelasjon kurver kan da trekkes fra disse svingningene og utstyrt med egnede matematiske spredning modeller 11.
FCS kan brukes til å bestemme lipid flåten oppdeling av ulike sonder, så lenge de er fluorescently tagget. Fluoriserende tagging kan oppnås ved uttrykk av fluorescerende fusion proteiner eller ved binding av fluorescerende ligander. Videre kan FCS brukes ikke bare i kunstige membraner og cellelinjer, men også i grunnskolen kulturer, som beskrevet nylig tolv. Den kan også brukes til å følge dynamikken i lipid flåte partisjonering etter narkotika tillegg eller membran lipidsammensetning forandring 12.
Protocol
Discussion
Den FCS metoden presenteres her gir en sensitiv og rask analyse av lipid flåten partisjonering av fluorescerende prober interessante i levende celler. FCS kombinerer nøyaktigheten av lokalisering av konfokalmikroskopi med følsomheten enkelt foton telling. Den største forskjellen mellom FCS og standard biokjemiske teknikker er at FCS gjør den absolutte bestemmelse av lipid flåter partisjonen av målet og ikke relative partisjonen som er tilfellet for DRMS isolasjon eller co-patching.
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Agence Nationale de la Recherche (ChoAD). Vi er også takknemlige til Fondation ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) for deres økonomiske støtte.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Cholera toxin subunit B-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | MW (pentamer) = 57 kg/mol |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Incubator for temperature and CO2 control | Life imaging services | The Cube and the Box | |
| SPAD (Single Photon Avalanche Diode) | MPD (Micro Photon Devices) | PDM serie (100 μm sensitive area) | |
| High pass 488 nm filter | Semrock | 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25 |
|
| FCS detection unit | Picoquant | Picoharp 300 module | |
| Acquisition and auto-correlation software | Picoquant | SymPhoTime | |
| Fitting software | OriginLab | OriginPro8 |
References
- Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Gerl, M. J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).
- Simons, K., Ehehalt, R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).
- Munro, S. Lipid rafts: elusive or illusive. Cell. , 115-377 (2003).
- Shaw, A. S. Lipid rafts: now you see them, now you don’t. Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).
- Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).
- Brown, D. A., London, E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).
- Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).
- Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes. Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).
- Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in living cells. Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).
- Marquer, C. Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).
- Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications. Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).
- Ilien, B. Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process. J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).
- Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).
- Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy. Biophys. J. 33, 435-454 (1981).
- Thompson, N. L., Steele, B. L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).
- Eggeling, C. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457, 1159-1162 (2009).
- Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).
- Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts. J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).
- White, R. Holin triggering in real time. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).
- Digman, M. A. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).
- Digman, M. A. Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure. Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).
- Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells. Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys. J. 92, 613-621 (2007).
- Bates, I. R. Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones. Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).
