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Neuroscience

लगातार निकोटीन प्रशासन के साथ चूहे तोड़े fluorescently टैग निकोटिनिक रिसेप्टर्स की वर्णक्रमीय इमेजिंग confocal

Published: February 10, 2012 doi: 10.3791/3516
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Victoria

Summary

हम CNS न्यूरॉन्स के विशिष्ट उपप्रकारों में से subcellular क्षेत्रों के भीतर निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर परिवर्तन को बढ़ाता बेहतर फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिसेप्टर की टैगिंग सहित तरीकों की एक संयोजन का उपयोग कर का उपयोग करने के दृष्टिकोण में दस्तक और वर्णक्रमीय से निकोटीन की लत के तंत्र को समझने का एक उपन्यास तकनीक विकसित की है confocal इमेजिंग.

Protocol

1. पम्प आरोपण

  1. पंप आरोपण से पहले भरने, और Alzet मिनी आसमाटिक पंप (Alzet, 2002 मॉडल, Cupertino, संयुक्त राज्य अमेरिका) सावधान किया जा रहा करने के लिए हवाई बुलबुले परिचय नहीं तैयार. मिनी आसमाटिक पंप के इस मॉडल 0.5 μl / घंटा की दर पर 14 दिनों के लिए समाधान देता है. बाँझ शर्तों सुनिश्चित करें. खाली और भरे पंप तौलना. प्रयोग (10 दिनों के आरोपण के बाद) के समापन पर, पंप में शेष तरल एक सिरिंज और सुई के साथ हटाया जा सकता है और पंप मात्रा की गणना करने के लिए वजन.
  2. नियंत्रण समाधान के साथ पंप्स खारा (संयुक्त राज्य अमेरिका 0.9% w / वी, Teknova, S5819, Hollister,) होते हैं. (-) निकोटीन हाइड्रोजन टार्ट्रेट (सिग्मा, N5260 # बिल्ली) नमक खारा में पतला है (0.9% w / वी) और एक .22 माइक्रोन फिल्टर सिरिंज के अंत के माध्यम से फ़िल्टरिंग द्वारा निष्फल निकोटीन समाधान के एक एम 1 स्टॉक समाधान तैयार. हम पहले 0.4 और 2 मिग्रा / किग्रा / घंटा (निकोटीन से मुक्त आधार के रूप में गणना) में 10 दिनों के लिए निकोटीन दिलाई.
  3. तीन खारा स्नान (तीन तैयार10 सेमी खारा पेट्री डिश) में भर गया. एक बार पंप भर दिया गया है और छाया हुआ है, प्रत्येक लगातार खारा के बाहरी कवच ​​पर दवा के किसी भी निशान हटाने के स्नान में अच्छी तरह से पंप धो लो. विसर्जित सर्जरी तक भंडारण के लिए नमकीन घोल में पंप भरा है, और अलग खारा कंटेनर में नियंत्रण निकोटीन पंप के रखने.
  4. एक स्वस्थ वसूली को प्रोत्साहित करने के लिए और शल्य चिकित्सा के बाद संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए, साफ पिंजरों लंबी अवधि वसूली के लिए तैयार है.
  5. अल्पकालिक तुरंत शल्य चिकित्सा के बाद वसूली के लिए, एक हीटिंग पैड और एक गर्मी दीपक युक्त पिंजरे तैयार.
  6. पुरानी निकोटीन प्रभाव की जांच करने के लिए हम 5 से 6 समयुग्मजी α4YFP दस्तक में प्रत्येक समूह में (2-3 महीने पुराने) चूहों (नियंत्रण या निकोटीन) α4YFP दस्तक माउस लाइन में से 10 पीढ़ियों के लिए C57BL/6J माउस तनाव backcrossed है. हमें यकीन है और सभी चूहों की उम्र, लिंग के अध्ययन के लिए वही कर रहे हैं और सभी सर्जरी एक ही दिन प्रदर्शन कर रहे हैं परिवर्तनशीलता को कम करते हैं. लुका को रोकने केदौरान और सर्जरी के बाद चूहों को pothermia, बाँझ शल्य कपड़ा में शामिल एक हीटिंग पैड के साथ शल्य मेज से लैस.
  7. 3 एल / मिनट ऑक्सीजन और 3% isoflurane के साथ दस्तक α4YFP माउस को प्रेरित और फिर बनाए रखने के 2.5 एल / मिनट ऑक्सीजन पर संज्ञाहरण और 1% isoflurane. हम isoflurane संज्ञाहरण पसंद करते हैं क्योंकि सर्जरी के पूरा होने पर isoflurane प्रणाली तेजी से साफ करता है और चूहों ~ 2 मिनट के भीतर जागरूक कर रहे हैं और मोबाइल. लागू करें आँख तुरंत बूँदें (फाड़ - जेल, नोवार्टिस) के corneal नुकसान से बचने के.
  8. पंप्स subcutaneously प्रत्यारोपित कर रहे हैं एक त्वचा चीरा के माध्यम से और गर्दन के पीछे यह पंप दुमदारी से वापस के पृष्ठीय पहलू के नीचे धक्का दे दिया है. मैट के लिए 95% इथेनॉल फर के साथ forelimbs के बीच पीठ पर क्षेत्र को साफ कर लें. 0.8mm Graefe संदंश के साथ त्वचा (ललित विज्ञान उपकरण, 11050-10) चुटकी और एक 1 सेमी केंद्रीय पार्श्व परितारिका (ललित विज्ञान उपकरण, 14060-10) कैंची का उपयोग कर कटौती करना है.
  9. पंप के लिए एक चमड़े के नीचे का स्थान बनाने के लिए, मानक पैटर्न कैंची सम्मिलितचीरा में और उन्हें जानवर के लांगुलिय अंत की ओर ध्यान से धक्का (ललित विज्ञान उपकरण, 14,101-14) के.
  10. 1.0 मिमी Graefe संदंश (ललित विज्ञान उपकरण, 11650-10) का प्रयोग, खारा से पंप को हटा दें. चीरा खुला का उपयोग संदंश पकड़ और चीरा में आसमाटिक पंप जानवर के लांगुलिय अंत का सामना करना पड़ टोपी के साथ पंप और सम्मिलित दुम का अंत करने के लिए पंप धक्का.
  11. चुटकी 0.8mm संदंश का उपयोग बंद घाव और Vetbond की एक पर्याप्त राशि (3M, बिल्ली 1469SB) गोंद लागू होते हैं. पकड़ जब तक घाव बंद है.
  12. Isoflurane मुखौटा से पशु निकालें, एनाल्जेसिक के साथ सुई, वसूली अल्पकालिक पिंजरे में जागरूक और मोबाइल तक meloxicam (सुप्रीम कोर्ट 0.1 मिलीग्राम / किग्रा), और जगह. फिर भोजन और पानी उपलब्ध यथेच्छ के साथ वसूली लंबी अवधि के पिंजरे में डाल दिया.

2. α4YFP माउस निर्धारण intracardiac छिड़काव द्वारा दस्तक

  1. एक दिन समाधान प्रक्रिया से पहले और 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ सभी चूहों की परिवर्तनशीलता को कम से कमएक ही दिन पर है और समाधान के एक ही बैच के साथ perfused जाएगा.
  2. एक अच्छी तरह संवातित क्षेत्र में छिड़काव fixations का प्रदर्शन करते हैं. DDH ओ के साथ 2, peristatic पंप (Masterflex पम्प नियंत्रक, ६०६४८ Masterflex आसान लोड, 7518-00) के लोगों को लाइन
  3. 20 मिलीलीटर पीबीएस 7.6 पीएच (Invitrogen, बिल्ली 70,011 #) ~ हेपरिन 0.0015g (सिग्मा, H4784 # बिल्ली), एक anticoagulant, जोड़ें.
  4. असंवेदनता उत्पन्न करना α4YFP intramuscularly ketamine की एक मिश्रण (25 मिलीग्राम / किग्रा, Wyeth के पशु स्वास्थ्य) और medatomidine के हाइड्रोक्लोराइड (0.25 मिलीग्राम / किग्रा, फाइजर) हिंद पैर की मांसपेशियों में इंजेक्शन लगाने के द्वारा माउस में दस्तक और तुरंत अपने घर पिंजरे में पशु वापस जगह है.
  5. एक स्टायरोफोम ढक्कन एक धातु ट्रे में सम्मिलित करने के लिए पशु पिन. 95% इथेनॉल के साथ छाती साफ कर लें. Adson (ललित विज्ञान उपकरण, 91106-12) संदंश और कटाव के साथ चुटकी त्वचा परितारिका कैंची के साथ वक्ष गुहा खोलें. Ribcage के एक अल्ट्रा ठीक hemostat (ललित विज्ञान उपकरण, 13021-12) का उपयोग दबाना और दिल बेनकाब.
  6. 4 मिलीग्राम / मिनट और मैं में पीबीएस पम्पिंग शुरू करोजानवर के बाएं वेंट्रिकल में एक 23g तितली सुई (Becton डिकिंसन, 367,253) nsert. तुरंत सही atrium कटाव के लिए रक्त की अनुमति और बच perfusate है.
  7. पीबीएस (7.6 पीएच) के 20 मिलीलीटर छिड़कना, 4% paraformaldehyde (7.6 पीएच, एक 16% पीएफए ​​स्टॉक से पीबीएस के साथ पतला, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान, १५,७१० # बिल्ली) के तो 30 मिलीलीटर, तो 5% sucrose के 20ml (7.6 पीएच) . हमने पाया है कि निर्धारण autofluorescence बढ़ जाती है. 5% sucrose के साथ छिड़काव मस्तिष्क है, जो autofluorescence कम करती से अवशिष्ट पीएफए ​​rinses.
  8. मस्तिष्क और 3 दिनों के लिए 30% sucrose में दुकान निकालें.
  9. राज्याभिषेक प्रोटोकॉल के लिए दिमाग को स्थिर करने के लिए, एक प्लास्टिक एम्बेडिंग मोल्ड में एक रेजर ब्लेड और जगह मस्तिष्क साथ सेरिबैलम में कटौती (VWR, बिल्ली 18,986-1 #) अक्टूबर बढ़ते यौगिक (ऊतक टेक, बिल्ली 4583 #) में विजय - स्तम्भ पक्ष और डूब . टुकड़ा करने की क्रिया से पहले सूखा और -20 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ की दुकान में रुक.
  10. एक cryostat पर और फिर धारा दिमाग (30 माइक्रोन मोटी) लेपित स्लाइड करने के लिए स्थानांतरण. -20 में मस्तिष्क वर्गों और स्टोरडिग्री, एक निर्जल कैल्शियम सल्फेट पत्थर युक्त स्लाइड बक्से में सी. स्लाइड बॉक्स एक ज़िप ताला सील बैग में होना करने के लिए नमी से बचने के लिए और बाद में फ्रीजर जला जब -20 डिग्री सेल्सियस पर रखना चाहिए

3. इमेजिंग फ्लोरोसेंट वर्णक्रमीय confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग nAChRs

  1. सुनिश्चित करें स्लाइड photobleaching कम से कम किसी भी प्रकाश स्रोत के लिए न्यूनतम जोखिम है.
  2. बढ़ते मध्यम है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रतिदीप्ति रोकना नहीं करता है के साथ मस्तिष्क अनुभाग स्लाइड coverslip. हम 4-88 Mowiol के साथ अच्छी सफलता (Tris - एचसीएल और ग्लिसरॉल में 8.5 पीएच, ईएमडी के Calbiochem, बिल्ली 475,904 #) है, जो कुछ घंटों के बाद और मज़बूत बनाता है. सुनिश्चित करें कि Mowiol हवाई बुलबुले से बचने के क्रम में फिसल कवर से पहले कमरे के तापमान को equilibrates. नेल पॉलिश के रूप में यह YFP प्रतिदीप्ति बुझाने फिसल कवर का प्रयोग न करें.
  3. छवियाँ एक Nikon C1si वर्णक्रमीय confocal सूक्ष्मदर्शी प्रणाली का उपयोग कर हासिल किया है. वर्णक्रमीय confocal इमेजिंग और रैखिक unmixing की विधि पर विवरण प्रदान कर रहे हैंडी 13-15 कहीं. एक वर्णक्रमीय confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करने के लिए तर्क है कि निश्चित मस्तिष्क ऊतक निहित autofluorescence है है. Nikon C1si पर वर्णक्रमीय इमेजिंग confocal कि नमूना फ्लोरोसेंट उत्सर्जित प्रकाश की तरंग दैर्ध्य के एक निर्धारित सीमा, इसके विभिन्न तरंगदैर्य में spatially एक चश्मे की तरह सफेद रंग की एक इंद्रधनुष में प्रकाश अपवर्ती एक झंझरी फैलानेवाला तत्व के माध्यम से refracted 32 photomultiplier ट्यूब डिटेक्टरों की एक सरणी का उपयोग करता है 16. ताकि उत्सर्जन स्पेक्ट्रम छवियों का एक लैम्ब्डा ढेर के प्रत्येक पिक्सेल के लिए एकत्र किया जाता है प्रकाश के विभिन्न तरंगदैर्य पर एकत्र छवियों एकत्र क्या छवियों का एक लैम्ब्डा ढेर है. चूंकि YFP और ऊतक autofluorescence प्रत्येक विशेषता वर्णक्रमीय हस्ताक्षर, लैम्ब्डा ढेर अलग YFP और autofluorescent संकेत (छवि 2) में एक रैखिक बीजीय unmixing एल्गोरिथ्म का उपयोग कर deconvolved किया जा सकता है. इस प्रकार, औ के महत्वपूर्ण स्तर के साथ YFP प्रतिदीप्ति बहुत सही मात्रा का ठहराव के ऊतकों में भी निर्धारित किया जा सकता हैtofluorescence.
  4. विभिन्न सेटिंग्स के लिए छवि गुणवत्ता और प्रतिदीप्ति संग्रह क्षमता का अनुकूलन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. हम सेटिंग्स हम आम तौर पर उपयोग की रिपोर्ट पर इन सेटिंग्स नमूना और confocal सूक्ष्मदर्शी के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. सही α4YFP सबयूनिट अभिव्यक्ति में परिवर्तन यों हम पुरानी निकोटीन के साथ यह सुनिश्चित करें कि सभी पिक्सल के संकेतों के ग्रे स्केल तीव्रता स्तर saturating के मूल्य से नीचे हैं (12 बिट ग्रे स्केल के लिए <4095). इसके अलावा, हम confocal सेटिंग्स समायोजित इतना है कि पिक्सल saturating के मूल्य का लगभग एक तिहाई (1300-1400 ~~) या कम से रिसेप्टर upregulation के कारण संकेत में संभावित वृद्धि के लिए समायोजित. एक बार सेटिंग्स को अनुकूलित कर रहे हैं, सेटिंग्स सभी इमेजिंग सत्र और नमूने के लिए समान रखा जाता है.
  5. 15% एक 40 मेगावाट आर्गन लेजर का अधिक से अधिक प्रसारण पर 488 एनएम लेजर लाइन: हम इमेजिंग α4YFP के लिए निम्नलिखित सेटिंग्स एक 60x तेल CFI योजना ए पी ओ कुलपति उद्देश्य (1.40 एनए, 0.13 मिमी काम दूरी) का उपयोग उपयोग, पर 220 वर्णक्रमीय डिटेक्टर लाभ, वर्णक्रमीय रेंज 5 एनएम संकल्प में 496.5 एनएम 656.5 एनएम से imaged किया, 512 x 50 माइक्रोन क्षेत्र x 50 माइक्रोन से अधिक 512 पिक्सल, एक मध्यम pinhole आकार (60 माइक्रोन diam), एक 4.08 पिक्सेल समय ध्यान केन्द्रित करना, दो स्कैन और ग्रे स्केल के 12 बिट से अधिक औसत.

4. वर्णक्रमीय confocal छवियों और छवि विश्लेषण रैखिक unmixing

  1. एक नमूना एक वर्णक्रमीय confocal सूक्ष्मदर्शी के साथ लिया छवि पर रैखिक वर्णक्रमीय unmixing प्रदर्शन, एक पहले YFP के लिए एक संदर्भ स्पेक्ट्रम और ऊतक autofluorescence के लिए एक संदर्भ स्पेक्ट्रम प्राप्त करना चाहिए.
  2. किसी भी संदर्भ स्पेक्ट्रम के लिए एक महत्वपूर्ण अपेक्षित शोर प्रतिदीप्ति एक ही लेजर लाइन के साथ अपने नमूनों की इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है imaged स्पेक्ट्रम के लिए एक उच्च संकेत प्राप्त है. हालांकि 514 एनएम आर्गन लेजर लाइन की एक उच्च उत्तेजना दक्षता YFP हम 488 एनएम लेजर लाइन के साथ छवि YFP के लिए पसंद करते हैं क्योंकि वहाँ YFP के शिखर उत्सर्जन से बेहतर जुदाई और 488 एनएम लाइन कम मैं उत्तेजित हैikely शिखर बिगाड़ना और एक पीक करने के लिए वृद्धि सहित पूरे YFP उत्सर्जन स्पेक्ट्रम प्राप्त कर सकते हैं. हम छवि घुलनशील YFP एक सेल लाइन में ट्रांसफ़ेक्ट ताकि एक मजबूत YFP संकेत प्राप्त की है और परिणामी YFP स्पेक्ट्रम संदर्भ स्पेक्ट्रा के हमारे पुस्तकालय में संग्रहीत किया जाता है. सेल लाइनों में व्यक्त अधिक ट्रांसफ़ेक्ट α4YFP भी के बाद से यह भी पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम के लिए एक उच्च संकेत प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. Autofluorescence छवि हम autofluorescence के संदर्भ स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों से wildtype माउस मस्तिष्क अनुभाग से है कि हम α4YFP माउस से छवि का इरादा और उनके इसी स्पेक्ट्रा प्राप्त. हम एक ही लेजर लाइन, 488 एनएम, और लगभग समान पैरामीटर का उपयोग कर छवि का उपयोग करें, हालांकि हम डिटेक्टर लाभ के बदल, लेजर तीव्रता या औसत इमेजिंग प्रदर्शन शोर से संकेत को अधिकतम.
  4. Α4YFP माउस की एक मस्तिष्क क्षेत्र से एक वर्णक्रमीय confocal छवि के प्राप्त करने के बाद, छवि तो इसके YFP और autofluor के में deconvolved हैescence संकेत के एक रेखीय वर्णक्रमीय unmixing एक ही मस्तिष्क क्षेत्र से YFP संदर्भ स्पेक्ट्रम और wildtype माउस autofluorescence के संदर्भ स्पेक्ट्रम का उपयोग एल्गोरिथ्म को लागू करने के द्वारा.
  5. अमिश्रित α4YFP तो छवि ऐसे ImageJ (के रूप में एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में खोला जा सकता है http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) और फिर मतलब पिक्सेल तीव्रता क्षेत्र के लिए ब्याज की गणना की है. ImageJ के लिए एक प्लगइन "loci_tools.jar" (बुलाया http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej ) Nikon / आईसीएस आईडी confocal फ़ाइलें आयात करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  6. हम ही रैखिक वर्णक्रमीय unmixing और विश्लेषण के लिए एक पृष्ठभूमि अवशिष्ट मूल्य प्राप्त करने के एक ही मस्तिष्क क्षेत्र में चूहों wildtype दोहराना.
  7. फिर एक मतलब में uncorrected α4YFP मूल्य (4.5) से पृष्ठभूमि अवशिष्ट मूल्य (4.6) subtracting द्वारा सही मतलब α4YFP तीव्रता प्राप्त है.

5. प्रतिनिधि परिणाम

हम एक प्रतिनिधि समयुग्मजी α4YFP छवि 3A माउस एक वर्णक्रमीय confocal सूक्ष्मदर्शी के साथ लिया से औसत दर्जे का habenula की छवियों का एक लैम्ब्डा ढेर के सच्चे रंग प्रक्षेपण दिखा. हम भी वही लैम्ब्डा ढेर छवि (3B छवि) से α4YFP सकारात्मक न्यूरॉन्स वाले ब्याज की एक क्षेत्र से उत्सर्जन स्पेक्ट्रम दिखा. एक अलग उत्सर्जन शिखर ~ 527 एनएम पर स्पष्ट है, जो YFP के शिखर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन है. औसत दर्जे का habenula पड़ोसी क्षेत्र उत्सर्जन 527 एनएम वर्णक्रमीय शिखर कमी, α4YFP nAChR सब यूनिटों की अनुपस्थिति का संकेत स्पेक्ट्रम से पता चलता है. संभव रैखिक वर्णक्रमीय unmixing महत्वपूर्ण उत्सर्जन की ओवरलैप (4 ​​छवि), YFP की जुदाई और autofluorescent संकेत के साथ YFP के संदर्भ स्पेक्ट्रा और माउस मस्तिष्क autofluoresence का उपयोग करने के बाद एक उपज α4YFP अमिश्रित छवि, एक autofluorescent. छवि और शेष चैनल है. Α4YFP फ्लू के स्पष्ट स्थानीयकरणorescence कसकर बांध के मध्यवर्ती habenula छवि (4) सोमा में पहचाना जा सकता है.

में हिप्पोकैम्पस α4YFP औसत दर्जे का perforant पथ, पथ tempero ammonic और 12 नाली में मुख्य रूप से स्थानीय है. ये हिप्पोकैम्पस के सभी glutamatergic स्फूर्तिदान हैं. हम α4YFP अभिव्यक्ति पर hippocampal perforant पथ छवि (5) में पुरानी निकोटीन के प्रभाव की जांच की. निकोटीन की पुरानी प्रशासन (2 मिलीग्राम / किग्रा / 10 दिनों के लिए घंटा) α4YFP प्रतिदीप्ति में एक महत्वपूर्ण वृद्धि नियंत्रण खारा इलाज चूहों (69 ± 14%) से पुरानी निकोटीन इलाज चूहों (पी = .001, Wilcoxon रैंक राशि परीक्षण) के परिणामस्वरूप ( चित्र 5)

चित्रा 1
चित्रा फ्लो 1. पुरानी निकोटीन के साथ α4YFP nAChR सब यूनिटों में छवि में परिवर्तन के लिए प्रक्रिया दिखा चार्ट. मिनी आसमाटिक पंप या तो खारा या निकोटीन के साथ भर रहे हैं और ऊंचे पहाड़ और में subcutaneously प्रत्यारोपितहा, 4YFP समयुग्मजी चूहों. के बाद 10 दिनों चूहों perfused और 4% paraformaldehyde और माउस दिमाग के साथ तय कर रहे हैं sectioned स्लाइड पर (30 माइक्रोन मोटी). मस्तिष्क अनुभाग एक वर्णक्रमीय confocal सूक्ष्मदर्शी (Nikon है C1si) के पर imaged है है और प्रेतसंबंधी YFP और autofluorescent छवियों में अमिश्रित. तो α4YFP छवियों आगे ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण कर रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2 के एक लैम्ब्डा एक वर्णक्रमीय confocal सूक्ष्मदर्शी से imaged किया है और रैखिक इसकी वर्णक्रमीय घटक में अमिश्रित ढेर के एक योजनाबद्ध आरेख. (ए) छवियों की एक लैम्ब्डा ढेर इकट्ठा किया जाता है. (बी) के एक लैम्ब्डा ढेर के प्रकाश के विभिन्न तरंगदैर्य पर एकत्र इतना है कि एक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम पूरे ढेर भर में प्रत्येक पिक्सेल के लिए एकत्र किया जाता है छवियों के होते हैं. (सी) के बाद से YFP और ऊतक autofluorescence प्रत्येक विशेषता वर्णक्रमीय हस्ताक्षर है, लैम्ब्डा ढेर है में एक रैखिक unmixing बीजीय एल्गोरिथ्म का उपयोग कर deconvolved किया जा सकता हैeparate YFP और autofluorescent संकेत. इस प्रकार, YFP प्रतिदीप्ति बहुत सही मात्रा का ठहराव भी autofluorescence के उच्च स्तर के साथ ऊतक में निर्धारित किया जा सकता है.

चित्रा 3
चित्रा 3 एक मस्तिष्क क्षेत्र α4YFP nAChRs व्यक्त की वर्णक्रमीय confocal छवि. (ए) एक α4YFP एक Nikon C1si वर्णक्रमीय confocal सूक्ष्मदर्शी के साथ लिया माउस से औसत दर्जे का habenula की छवियों का एक लैम्ब्डा ढेर के एक सच्चे रंग प्रक्षेपण. (बी) ब्याज की एक क्षेत्र है, जो युक्त α4YFP (हरा) न्यूरॉन्स, और औसत दर्जे का habenula (लाल) के बाहर ब्याज की एक क्षेत्र शामिल स्पेक्ट्रा से भूखंड.

चित्रा 4
चित्रा 4 औसत दर्जे का habenula रैखिक वर्णक्रमीय unmixing. अमिश्रित α4YFP की (ए) छवियाँ और (बी) autofluorescence निम्नलिखित रैखिक वर्णक्रमीय unmixing. (सी) YFP के संदर्भ स्पेक्ट्रा (हरा त्रि) कोण और autofluorescence (पीला हलकों) वर्णक्रमीय unmixing के लिए इस्तेमाल किया.

चित्रा 5
चित्रा 5 α4 nAChRs में के हिप्पोकैम्पस में upregulation α4YFP दस्तक पुरानी निकोटीन के संपर्क में चूहों में. (ए) हिप्पोकैम्पस से α4YFP प्रतिदीप्ति की टाइलों संग्रथित. दो धराशायी चयन क्षेत्रों हिप्पोकैम्पस जहां विश्लेषण प्रत्येक माउस के लिए प्रदर्शन किया गया perforant पथ अवर अंग पर अनुमानित स्थानों रहे हैं. (बी) α4YFP प्रतिदीप्ति पुरानी खारा (*, पी = .001, Wilcoxon रैंक राशि परीक्षण) से पुरानी निकोटीन से अवगत कराया चूहों के perforant पथ में काफी अधिक था. परिणाम मतलब ± SEM के n = दोनों खारा और पुरानी निकोटीन इलाज चूहों (प्रत्येक उपचार समूह के लिए 5 चूहों) के लिए 20 माप प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 6
6 आंकड़ा बेहतर चाहते हैं.α4YFP की epth अभिव्यक्ति के रूप में एंटीबॉडी लेबलिंग की तुलना में. XZ Cy5 माध्यमिक लेबल (बी) के रूप में साथ α4YFP (ए) प्रतिदीप्ति और VGlut2 प्रतिरक्षी की orthogonal देखा गया. (सी) एंटीबॉडी धुंधला (काला) वर्ग के लिए गहराई पर अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता गिरावट दिखा रहा है के रूप में α4YFP (खुला हलकों) की तुलना में भूखंड.

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Discussion

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

एंथोनी Renda विक्टोरिया ग्रेजुएट फैलोशिप पुरस्कार के एक विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया. MYRE और विनिईेड सिम फंड, अभिनव अनुदान, एक ब्रिटिश कोलंबिया नॉलेज डेवलपमेंट फंड के लिए एक कनाडाई फाउंडेशन इस शोध एक प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद कनाडा डिस्कवरी अनुदान, एक NARSAD युवा अन्वेषक पुरस्कार (आर.एन. के लिए), एक विक्टोरिया फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया और प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद कनाडा अनुसंधान उपकरण और इंस्ट्रुमेंटेशन अनुदान की. हम जिलियन मैके, क्रिस्टीना बार्न्स, एरियल सुलेवान, जेनिफर मैकडोनाल्ड और डैनियल Morgado उत्कृष्ट माउस पालन के लिए धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mini-osmotic pumps Alzet model 2002
saline TEKnova, Inc. S5819
(-)-nicotine hydrogen tartrate salt Sigma-Aldrich N5260
eye drops Novartis AG Tear-Gel
Vetbond glue 3M 1469SB
heparin sodium salt Sigma-Aldrich H4784
10x PBS Invitrogen 70011
ketamine Wyeth Animal Health 0856-4403-01
medatomidine hydrochloride Pfizer Pharma GmbH 1950673
23G butterfly needle BD Biosciences 367253
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
plastic embedding mold VWR international 18986-1
O.C.T. Mounting Compound Tissue-Tek 4583
Mowiol 4-88 EMD Millipore 475904 pH 8.5

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References

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तंत्रिका विज्ञान 60 अंक निकोटीन की लत तोड़े में चूहों वर्णक्रमीय confocal इमेजिंग पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर्स
लगातार निकोटीन प्रशासन के साथ चूहे तोड़े fluorescently टैग निकोटिनिक रिसेप्टर्स की वर्णक्रमीय इमेजिंग confocal
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Renda, A., Nashmi, R. Spectral… More

Renda, A., Nashmi, R. Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration. J. Vis. Exp. (60), e3516, doi:10.3791/3516 (2012).

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