Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kutan leishmaniasis i den dorsale hud af hamstere: en nyttig model til screening af Antileishmanial Drugs

doi: 10.3791/3533 Published: April 21, 2012

Summary

Optimering af den eksperimentelle hamster-model for kutan leishmaniasis ved intradermal injektion af

Abstract

Traditionelt hamstere eksperimentelt inokuleret i snuden eller trædepuden. Imidlertid i disse sites et sår ikke altid forekommer, måling af læsionsstørrelse er en hård procedure og dyr viser vanskeligt at spise, ånde og bevæge sig på grund af læsionen. For at optimere hamster-model for kutan leishmaniasis, unge voksne mandlige og kvindelige guldhamstere (Mesocricetus auratus) blev injiceret intradermalt på den dorsale hud med 1 til 1,5 x L0 7 promastigoter af Leishmania arter og progression af efterfølgende læsioner blev evalueret i op til 16 uger efter infektion. Den gyldne hamster blev valgt, fordi det anses for passende bio-model til evaluering af lægemidler mod Leishmania, som de er modtagelige for infektion med forskellige arter. Kutan infektion af hamstere resulterer i kroniske, men kontrolleret læsioner, og et klinisk udvikling med tegn svarende til dem observeret hos mennesker. Derfor, etablering of omfanget af infektion ved måling af størrelsen af ​​læsionen ifølge området indurations og sår er mulig. Denne fremgangsmåde har bevist sin alsidighed og nem håndtering under podning, opfølgning og karakterisering af typiske læsioner (sår), anvendelse af behandlinger gennem forskellige måder og opnåelse af kliniske prøver efter forskellige behandlinger. Ved hjælp af denne metode kvaliteten af ​​dyrelivet med hensyn til bevægelse, søge efter mad og vand, leg og sociale aktiviteter isalso bevaret.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Infektion af hamstere

1. Dyr

Indavlede kvindelige og mandlige guldhamstere (Mesocricetus auratus), 6-8 uger, der vejer 140-160 g anvendes. De huse på dyret anlægget i temperaturstyret indkvartering, fodret med standard gnavere tørret mad og forsynet med vand ad libitum. Alle de procedurer, der involverer dyr er godkendt af den institutionelle Etisk Komité for Experimental Animal Use. Før eksperimentel infektion med dermotropic Leishmania parasitter dyrene er sexede, mærket og vægtet efter standardiserede procedurer. For kønsbestemmelse, er dyrene inspiceret for særlige funktioner, såsom visualisering af bryst-linjen og den korte ano-genital afstand hos kvinder, eller visualisering af testikler og en større afstand mellem anus og forhuden hos mænd. Derefter blev dyrene kendetegnet ved ørepiercing eller ved farvning et område af huden med en servieti picrinsyre. For øret perforering øret efter ren med 70% alkohol er gennembrudt ved hjælp af et øre dorn for gnavere. En region med blodkar skal undgås. Sedering eller anæstesi med en blanding 09:01 af ketamin (50 mg / kg) og Xilacine (20 mg / kg) intraperitonealt i et volumen på 260-300μl 25-G nål anbefales. Endelig vejes dyrene ved at anbringe dem i en fælde eller kasse, der er betinget af en præcisionsvægt.

2. Parasitter

Promastigoter i dermotropic Leishmania arter, såsom L. amazonensis, dyrkes i tofaset Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) dyrkningsmedium ved 26 ° C. Metacyclic (stationær) fase promastigoter (5 dage) areused at inficere hamstere. Kort fortalt parasitter høstet, vasket to gange med phosphatbuffer (PBS), talt og justeret til 1 x 10 7 (for mænd) eller 1,5 x 10 7 (for kvinder) parasitter i 0,1 ml PBS til podning mand eller kvinde, henholdsvisImidlertid kan inoculums størrelse varierer i overensstemmelse med Leishmania arter (fremgangsmåde ikke vist i video).

3. Eksperimentel infektion

Et hudområde barberes før inokulering. Kort fortalt er de bedøvede dyr anbragt i bugleje og saks, håret fjernes to inches fra haleroden. Efter rense barberede område med steril saltvandsopløsning parasitten inokulum injiceret intradermalt, indtil en papel dannes.

4. Klinisk opfølgning

Dyr overvåges hver 7 dage op til 4 - 6 uger efter inokulering for udseendet af læsionen. Kort, er dyr immobiliseres i en fælde og det inokulerede hudområde er palperes. Derefter induration område af den dannede mavesår afgrænset og bredden og længden af ​​såret måles med en digital skydelære.

2. Behandling af hamstere

1. Adminstration af forbindelserne

Behandlingsplanen begynder, når dyrene har udviklet ulcererede læsioner (4-6 uger efter inokulering). Dyrene fordelt i grupper på 5-6 dyr i hver forbindelse, der skal testes. Forbindelserne kan indgives ved topiske, orale, intramuskulære eller intralæsionale veje. Før påføring af lægemidler, er hamstere bedøvet, og læsionen området renses med saltopløsning eller PBS. Når forbindelsen tilføres via topisk eller intralæsional, er hamstere immobiliseret i fælder, der gør udsætte det område til behandling, mens, når forbindelsen indgives ved oral eller intramuskulær vej hamsterne er sikkert fastgjort ved bunden af ​​halsen. a) Topisk applikation: forbindelsen isapplied på læsion, og efter få minutter dyret tilbage til cage.b) Til intramuskulær injektion er lægemidlet injiceret (200 ul maksimum) gennem semitendinous eller semimembranous bagpartiets muskulatur. c) For oral administrering, er medikamentet leveres til dyret (200 ul maksimum) gennem en oro-gastrisk sonde 14G forbundet til en 1 ml sprøjte. d) For intralæsional injektion af lægemidlet (100 ul maksimum) gradvist injiceres ved bunden af ​​såret med en 26G nål med det koniske placeret ned. Hele området af læsionen er dækket af rotation af nålen. Behandlinger administreres dagligt i 10-20 dage efter den definerede terapeutiske ordning.

2. Klinisk opfølgning

Fordi denne eksperimentelle model af effektiviteten af ​​nye antileishmanial forbindelser bestemmes i henhold til den helbredende og ardannelse af læsioner efter behandling, er en klinisk monitorering af hvert dyr udført ugentligt ved afslutningen af ​​anvendelsen af ​​forbindelsen og op til tre måneder efter. Under overvågningen bliver typen af ​​læsion, der er beskrevet og induration og sårarealet måles med en digital skydelære. Tilstedeværelsen af ​​læsioner i forskellige regioner tilpodningsstedet samt forekomsten af ​​tilbagefald af læsionen er også beskrevet og registreret. Hver to uger, er dyrene vejet og læsioner er afbilledet. Dyrene observeres dagligt at overvåge: a) fysiske udseende (hår, koordinering, temperatur, øjne, placering af ørerne, grooming, afføring, tilstedeværelse af ascitesvæske, agitation og dehydrering) og b) adfærd (vågen, klar, nysgerrig, opmærksom , bliver med gruppen, ser frem til mad og drikke, og svære at fange). Stedet for anvendelse af forbindelsen observeres også for tilstedeværelse af hyperæmi, inflammation og bidende og hårfjerning.

Hamstere er også årelades på dag 45 efter afslutningen af ​​behandlingen for at bestemme de hæmatologiske og serologiske værdier, der kan være associeret med toksicitet af forbindelserne (se nedenfor).

Effektiviteten af ​​hver behandling vurderes at sammenligne læsionsstørrelser før og efter behandling ved hjælp af følgende score System: hærdet (heling af 100% areal og fuldstændig forsvinden af læsionen), klinisk forbedring (reducere størrelsen af læsionen i> 50% af det areal); klinisk svigt (forøgelse af størrelsen af læsionen) tilbagefald på læsion efter hærdning). Ved afslutningen af ​​undersøgelsen blev dyrene aflivet ved inhalation af CO2 foregående anæstesi. Efter døden, er de nødvendige prøver til parasitologisk, histologisk og serologisk analyse taget.

3. Parasitologiske eksamener

Tilstedeværelsen af Leishmania i prøver fra hud (læsion eller ar), der lever, milt og nyre bestemmes direkte ved at undersøge smears farvet med Giemsa 1 og histopatologisk undersøgelse af disse væv (se nedenfor).

Parasitten belastning i læsionsstedet estimeres ved grænsen fortynding assay ifølge Titus og kolleger (1985) 2. Kort fortalt er en lille stykke af vævet fjernetfra hvert dyr, vejes og homogeniseres i kold PBS-opløsning ved hjælp af et sprøjtestempel. Den opnåede suspension centrifugeres ved 600 g i 10 minutter ved 4 ° C. Derefter blev supernatanterne fjernet, og pelletene resuspenderes i RPMI 1640-medium suppleret med 1% antibiotika og 10% føtalt kalveserum. Hundrede l af suspensionen overføres til hver af de 96 brønde til mikrotiterpladen indeholdende NNN medium overlejret med 50 ul Schneider medium og holdt ved 26 ° C. Antallet af levedygtige parasitter i hver prøve bestemmes ud fra den højeste fortynding, ved hvilken promastigoter kunne påvises ved undersøgelse under et inverteret mikroskop hver uge til en måned.

4. Histopatologisk undersøgelse af hudlæsioner (eller ar) og andre væv

En tredje stykke af biopsi udtaget fra hud, lever og nyre er fikseret i 10% formalin og indlejret i paraffin. Prøve fra milt og hjerte kan også behandles. Five mikron dele af fikserede væv blev farvet med haemotoxilin-eosin og undersøgt under et optisk mikroskop med 200 gange, 400X eller 1000X olieimmersion at studere mikro arkitektur karakteristika cellulære infiltrat, og tilstedeværelsen eller fraværet af parasitter. Mikrofotografier er taget og digitale billeder taget til fange.

5. Evaluering af behandlingen toksicitet

Toksiske aktivitet af forbindelsen er baseret på fysiske og adfærd tilstand af dyr ifølge den parametre overvåges under klinisk opfølgning (se ovenfor). Toksicitet er også bestemmes ifølge hæmatologiske og metaboliske parametre i blodprøver og histopatologiske ændringer blev observeret i vævssnit farvet med haemotoxilin-eosin som beskrevet ovenfor.

Blodprøver fra hjertet, fortrinsvis ventrikel. Til hæmatologiske test, er blod overføres til EDTA antikoagulerede rør og behandles i overensstemmelseat standardisere protokoller for komplet blodtælling. Til serologiske tests, blodet overføres til 1,5 Eppendorf hætteglas og centrifugeret til opnåelse af serum for metabolisk analyse af kreatinin, ALT og BUN-niveauer målt under anvendelse af Kodak Ektachemdry kemi 3.

6. Dataanalyse

Data fra behandlede og ubehandlede dyr sammenlignes ved anvendelse af ANOVA-testen. Signifikans sat til p <0,05.

4. Repræsentative resultater

Oversigt

Hamster-model af kutan leishmaniasis blev forbedret med henblik på anvendelse af denne model lægemiddeleffektivitet screening. Læsion udvikling og parasitologiske parametre blev undersøgt ved primær infektion i dermal hud af hamstere. Indavlede kvindelige og mandlige guldhamstere (Mesocricetus auratus), 6-8 uger blev injiceret intradermalt med 1 x 10 7 (for mænd) eller 1,5 x 10 7 (for kvinder) metacyclIC (stationær fase) promastigoter L. amazonensis. Noduler viste 20 - 35 dage pi med sår, der efter 4-6 uger pi Efter infektion blev etableret, blev effekten af ​​pentavalent antimon (SBV) ved to doser evalauted. Hamstere blev randomiseret i tre grupper på 5 dyr hver og behandlet med meglumin antimoniate ved 80 eller 120 mg SBV / kg dagligt i 10 dage ved intramuskulær vej. Den tredje gruppe blev behandlet intramuskulært med PBS som placebo. En gruppe af tre dyr var ubehandlede og anvendt som en negativ kontrol. Reaktionen på hver behandling blev fulgt op 3 måneder efter afslutningen af ​​behandlingsperioden.

1. Klinisk kursus efter L. amazonensis infektion i den gyldne hamster (Mesocricetus auratus)

Hamstere inficeret i den dorsale hud konsekvent udvikle klinisk evident ulceration af epidermis på 4-6 uger efter infektionen. Læsioner begynde med små knuder og slutter sår,stigning i størrelse efter den tid, post-infektion og nå, hvad der blev anset for en optimal størrelse til evaluering af effekten af eksperimentelle lægemidler fra fjerde til sjette uge efter infektion (18,99 til 54,7 mm 2 til 4 uger og 35,55 til 92,71 mm 2 til 6 uger) (Figures1, 2). Læsioner efterfølgende opretholdes en tydelig sår i op til 20 uger efter infektion, på hvilket tidspunkt forsøgene blev afsluttet (Figur 1).

Infektion med L. amazonensis påvirker ikke legemsvægt hamstere, der varierede fra 104,9 til 124,69 g og 129,71 til 134,02 g i uinficerede og inficerede hamstere (p> 0,05, ANOVA). Dyrene fik i gennemsnit 25,58 ± 5,98% af kropsvægten i løbet af undersøgelsen. De seric værdier af creatinin og alaninaminotransferase (ALT) og hæmogram parametre svarede til referenceværdier i inficerede og Leishmania inficerede hamstere. Kun BUN urea-nitrogen (BUN)-niveau var enugmented i 60% af inficerede dyr.

Histopatologisk analyse af læsioner i hamstere inficeret med L. amazonensis viste forskelle i forbindelse med disse inficerede dyr. I almindelighed udviser hudbiopsier fra hamstere inficerede ingen inflammatorisk reaktion eller histologiske ændringer (figur 3a), medens der er inficeret med L. amazonensis udvikle en granulomatøs dermatitis og rigelige tilstedeværelse af makrofager infiltrerede dermis (figur 3b). Histopatologisk analyse af væv fra hamstere inficeret med L. amazonensis og behandles med meglumin antimoniate ved doser på 80 og 120 mg SBV / kg / dag i 10 dage viste ændringer associeret med infektionen proces svarende til dem observeret i kontrolgruppen (inficerede og ubehandlede). I almindelighed udviste hudprøver fra hamstere en svag grad af plasmocytes (20%) og PMN (80%) celler ledsaget af moderat infiltration af lymfocytter (80%) og en mild (20%) og alvorlig (80%) infiltrtion af makrofager (Tabel 2). Disse observationer svarer til en diagnostisk af granulomatøs dermatitis, en inflammatorisk begivenhed, kompromiser dermis og underliggende muskel. Dette er den primære læsion er forbundet til den infektion, som er kompatibel med den alvorlige manifestation af kutan leishmaniasis hos alle dyr i undersøgelsen. Denne association var statistisk korreleret ved chi-kvadrat af Pearson, hvilket gav p <0,05. Nyreprøver fra 60-100% af dyrene udviste moderat hyperplasi i nyrebark og frøkernerne ledsaget af let atrofi af nyrerne hos 75% af dyrene. Disse observationer er i overensstemmelse med membranen proliferativ glomerulonefritis, en diagnose som tidligere er blevet associeret med infektion med infektion med andre Leishmania arter. Statistical Association var stor en chi-kvadrat Pearson p <0,05. Lever fra 40-100% af dyr i alle grupper viste små vakuolære ændringer i hepatocytter, som kan være forbuned til fysiologiske processer, såsom hepatocytic akkumulering af glycogen. Andre levervæv abnormiteter såsom fedtsyre degeneration, fibrose og overbelastning svarer til infektionsprocessen. Andre observationer såsom vakuolære ændringer i hepatocytter, cardiomegalies, tilstedeværelsen af ​​indeslutninger af intracytoplasmatiske eosinofiler, såvel som vakuolisering af celler i de renale rør ikke statistisk forbundet (p> 0,05) til en toksisk virkning af den afprøvede forbindelse og sandsynligvis på grund af en fysiologisk proces i hamstere.

2. Terapeutiske virkning af meglumin antimoniate i hamster-model

Den kliniske fænotype inficerede hamstere på forskellige tidspunkter efter behandling er sammenfattet i tabel 1. Behandling med intramuskulær meglumin antimoniate i en dosis på 120 mg SBV / kg / dag i 10 dage vægt var yderst effektivt inducerer fuldstændig regression af L. amazonensis læsioner i alle dyr (Figur 4). Procentdelen af ​​hærdning var 100% i 2 og 8 uger efter behandlingsperioden. Men efter tre måneder tilbagefald af læsionen blev observeret hos 20% af hamstere. Når meglumin antimoniate blev administreret i 80 mg SBV / kg legemsvægt, blev fuldstændig helbredelse kun observeret i 3 dyr. I de andre to dyr læsionen faldt med 33,9 og 69,0% (Figur 5). Efter tre måneder, L. amazonensis forblev til stede i huden på alle dyr behandlet med meglumin antimoniate i en dosis på 80 mg SBV / kg / dag, og kun et af dyrene behandlet med 120 mg SBV / kg / dag af meglumin antimoniate. En helbredende dosis intramuskulær 120 mg SBV / kg / dag i 10 dage, blev bestemt.

Ved hjælp af begrænsende fortynding assay det anslåede antal parasitter viste en signifikant reduktion i den behandlede gruppe med meglumin antimoniate i sammenligning med negative (ubehandlet) kontrol og vehikel (placebo) behandlede gruppe (p <0,001). Levedygtige parasitter (0,4-1Blev 6 parasitter per mg af hudvæv) detekteres i læsionsstedet af ubehandlede dyr og patienter behandlet med PBS. Parasitter blev først isoleret fra disse dyr, som ikke responderer på behandling med meglumin antimoniate: et dyr behandlet med 120 mg / kg / dag (fig. 5b) og to hamstere blev behandlet med 80 mg / kg / dag (fig. 5c). Ingen forskel blev observeret i parasitten belastningen af ​​hamstere, der ikke hærder efter modtagelsen meglumin antimonite i sammenligning med de dyr, ubehandlede eller behandlet med PBS.

I histopatologi af hud biopsier fra hamstere behandlet med intramuskulær meglumin antimoniate ved 120 mg SBV / kg / dag ingen parasitter er overholdt; få makrofager og lymfocytter infiltrerende dermis ses (figur 6a, 6b). Ved modsatte når hamstere blev behandlet med meglumin antimoniate ved 80 mg SBV / kg / dag, granulomatøs dermatitis med rigelige tilstedeværelse af makrofager infiltrerede dermis omfattende observeret (fig. 6c, 6d).

Anvendelse af den samme terapeutiske ordning for undersøgelse af effekten, toksicitet meglumin antimoniate ved 80 og 120 mg SBV / kg legemsvægt blev evalueret. Generelle sundhedstilstand og kropsvægt blev overvåget i op til 3 måneder efter den sidste dosering. Behandling med påvirkede ikke legemsvægt hamstere, der varierede fra 104,9 til 124,69 g og 129,71 til 134,02 g i uinficerede og inficerede hamstere, hhv. Dyrene fik i gennemsnit 27,59 ± 4,22% af kropsvægten i behandlingen og 28,74 ± 2,26% ved opfølgningen (p> 0,05, ANOVA). Vægttabet blev ikke observeret i nogen behandlingsgruppe (data ikke vist). De seric værdier af creatinin og alaninaminotransferase (ALT) og hæmogram parametre svarede til referenceværdier i ubehandlede og meglumin antimoniate behandlede hamstere. Kun BUN urea-nitrogen (BUN) niveau blev forøget i 20% af behandlede dyr.

Histopathological analyse af væv fra hamstere inficeret med L. amazonensis og behandles med meglumin antimoniate ved doser på 80 og 120 mg SBV / kg / dag i 10 dage viste ingen ændringer associeret med lægemiddeltoksicitet.

Tabel 1
en phosphatpuffersaltopløsning, b dage efter behandling.
Tabel 1. Klinisk fænotype af L. amazonensis eksperimentelt inficerede hamstere efter behandling med meglumin antimoniate

Effektiviteten af hver behandling blev vurderet sammenligning læsionsstørrelser før og efter behandling under anvendelse af følgende pointsystem: hærdning (heling af 100% areal og fuldstændig forsvinden af læsionen), klinisk forbedring (reducere størrelsen af læsionen i> 50% af området) klinisk svigt (forøgelse af størrelsen af læsionen) tilbagefald (reaktivering af læsion efter hærdning).


A: fraværende tegn NA: ikke relevant, m: mild, M: moderat, S: alvorlig; PMN: polymorfnukleære neutrofiler, NSL: Ingen signifikant læsion; GDM: granulomatøs dermatomyositis; PGD: Pyogranulomatous dermatitis. 1. Lymphangiectasia 2. Mineral-lignende materiale.
Tabel 2 nedenfor. Histopatologi af huden af hamstere eksperimentelt inficeret med L. amazonensis og behandlet med meglumin antimoniate

Figur 1
Figur 1. Kursus i hudlæsion udvikling efter infektion i hamstere podet intradermalt med 1-1,5 x 10 7 L. amazonensis metacyclic (stationær fase) promastigoter i 20 uger. Aksen y repræsenterer sårarealet i mm.

Figur 2
Figur 2. Photographyic historie udvikling er sår læsion i den dorsale hud af en gylden hamster efter intradermal inokulation af 10 x 10 7 ved 2 uger (a), 4 uger (b) og 6 uger (c).

Figur 3
Figur 3 hudbiopsi fra (a) hamster uinficeret og ubehandlet. Ingen inflammatorisk reaktion hverken væsentlig histologiske ændring overholdes; (b) hamster inficeret og ubehandlet: granulomatøs dermatitis med tilstedeværelse af flerkernede kæmpeceller (pil plus stjerne) og rigelige parasitter (sort pile) og makrofager (hvide pile) infiltrerer dermis. Hæmatoxylin-eosin-pletning 400x.

Figur 4
Figur 4. Fotografisk historie klinisk respons hamstere inficeret med L. amazonensis og behandlet med intramuskulær meglumin antimoniate ved 120 mg SBV / kg / dag Durin g 10 dage. Billeder viser udseendet af læsionen, før behandling (a), ved slutningen af ​​behandlingen (dag 10) (b), og ved opfølgningen: dag 30 (c), 60 (d) og 90 (e) efter behandling.

Figur 5
Figur 5. Effektivitet meglumin antimoniate i behandlingen af kutan leishmaniasis i hamstere. Guldhamstere blev inficeret med L. amazonensis i den dorsale hud. Efter 6 ugers infektion var de ubehandlede (a) eller behandlet intramuskulært i ti dage med PBS alene (b), meglumin antimoniate 120 mg SBV / kg / dag (c) eller 80 mg SBV / kg / dag (d). Diagrammer viser procentdelen af ​​faldet i læsionsstørrelse ved slutningen af ​​behandlingen (dag 0) og på dag 15, 30, 60 og 90 af opfølgning efter afslutningen af ​​behandlingen. p <0,001 for 120 eller 80 mg SBV / kg / dag vs køretøjet og ikke behandling.

"/>
Figur 6. Hudbiopsi fra hamstere inficeret og behandlet med intramuskulær megumine antinmoniate ved 120 mg SBV / kg / dag (a, b) og 80 mg SBV / kg / dag (c, d). Tilstedeværelsen af ​​knappe makrofager og lymfocytter infiltrerer dermis. Ingen parasitter overholdes. Hæmatoxylin-eosin pletten 200x (a), 1000x (c) granulomatøs dermatitis med rigelige tilstedeværelse af makrofager infiltrerede dermis omfattende (c). Foamy makrofager med phagocyted parasitter. Hæmatoxylin-eosin plet 200x (b), 1000x (d).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kutan leishmaniasis er endemisk i troperne og nye verden. Det er ofte omtalt som en gruppe af sygdomme på grund af varierende spektrum af kliniske manifestationer, der spænder fra små kutane noduler grov slimhindevæv ødelæggelse. Mest tilgængelige lægemidler er dyre, kræver lange behandlingsforløb og bliver stadig ineffektive, hvilket nødvendiggør opdagelsen af ​​nye lægemidler.

Musemodellen er almindeligt anvendt, men har nogle ulemper. Således for eksempel på grundlag af den læsion, der udvikles efter intradermal injektion af promastigoter i dermotropic Leishmania arter, kan musene inddelt i tre grupper: en stærkt modtagelige med vedvarende infektion er karakteriseret ved en ekspanderende ulcerøs læsion som vist i BALB / c og DBA / 2, DBA / 3 mus, en relativt modstandsdygtig gruppe, hvor læsioner kan løses inden for 8 uger, som ses i CBA / H, C3H/He og A / J og en meget modstandsdygtig gruppe, hvor nogen reel læsion typiskcal af kutan leishmaniasis på injektionsstedet som det ses i NZB og C57BL / 6 mus 4. I modsætning til den murine model af kutan leishmaniasis hvor forløbet af sygdommen markant forskellig blandt forskellige almindelige indavlede musestammer og Leishmania arter, det gyldne hamster Mesocricetus auratus anses for passende bio-model til evaluering af lægemidler mod Leishmania arter, som de er modtagelige til infektion med forskellige arter af Leishmania. 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14. Podning af metacyclic (stationær fase) promastigoter i en af dermotropic Leishmania arter er i stand til at forårsage kutane læsioner mellem en og to måneder efter inokulering. Læsioner bliver åbenlyse 20 dage pi som papler der har udviklet sig til knuder og senere, til mavesår. Afhængigt af podningsstedet (PE tryne, foodpad, øre eller base hale) hamster viser en forudsigelig sygdomsudviklingen efter eksperimentel infektion fleste the tid præget af udvikling af en kronisk er sår lokal læsion svarende til dem, der observeres i mennesker med kutan leishmaniasis. Imidlertid, som hos mennesker, varierede læsioner i størrelse afhængig af immunstatus for hver enkelt, og derfor i visse hamstere et forsøg på at løse læsionen og dermed reduktion af størrelsen af ​​læsionen kan ses.

Selv om denne artikel beskriver den eksperimentelle infektion i den dorsale hud af hamstere med promastigoter L. amazonesis denne model er også muligt for andre dermotropic Leishmania arter, kun at ændre størrelsen af podestoffet. Sammenfattende demonstrerer fremgangsmåde intradermal injektion af promastigoter i den dorsale hud, at de kliniske og patologiske træk ved kutan leishmaniasis fremkaldt i den dorsale hud hamstere er bemærkelsesværdigt ens for human sygdom. Derudover klinisk opfølgning af sår efter behandling med specifikke forbindelser eller dtæpper lettes i denne model af induceret CL i dorsal hud. Udviklingen af ​​læsioner let bestemmes ved at sammenligne størrelsen af ​​læsionen opnået før og efter behandling. Den kliniske respons i form af helbredelse let følges ifølge reepitelialisering (som set i figur 4). Vi konkluderer, at eksperimentel infektion i den dorsale hud af hamstere med Leishmania arter er en nyttig model til at validere potentialet af forbindelser, der er kandidater til antileishmanial narkotika.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Udvalget for forskning på University of Antioquia (CODI), Den colombianske institut for udvikling af videnskab og teknologi - COLCIENCIAS og Center for Udvikling af produkter mod tropesygdomme - CIDEPRO.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Ketamine Reagent Holliday –Scott S.A
Xilacine Reagent Synthesis
PBS Reagent GIBCO, by Life Technologies 14190-136
Digital caliper Equipment Fisher Scientific 15-077-958
Giemsa Reagent Sigma-Aldrich GS1L-1L
Formalin Reagent Nova lab 11273
Paraffin Reagent Pechiney Plastic Packaging PM-996
Haemotoxilin Reagent Nova lab 10870103
Eosin Nova lab 10870203
Kodak Ektachem dry chemistry Equipment Kodak Ektachem DT-60
meglumine antimoniate Reagent Aventis
Microscopy Equipment Nikon Instruments YS2-T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Control of the leishmaniasis. Report of a Meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis WHO. 949, (2010).
  2. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunol. 7, 545-555 (1985).
  3. Reynolds, K. M. The Kodak Ektachem dry layer technology for clinical chemistry. Upsala. J. Med. Sci. 91, 143-146 (1986).
  4. Handman, E., Ceredig, R., Mitchell, G. F. Murine cutaneous leishmaniasis: disease patterns in intact and nude mice of various genotypes and examination of some differences between normal and infected macrophages. Australian J. Exp. Biol. Med. Sci. 57, 9-29 (1979).
  5. Hanson, W., Chapman, W., Waits, V., Lovelace, J. Development of Leishmania (Viannia) panamensis lesions and relationship of numbers of amastigotes to lesion area antimony-treated and untreated hamsters. J. Parasitol. 77, 780-783 (1991).
  6. Henao, H. H., Osorio, Y., Saravia, N. G., Gómez, A., Travi, B. Efficacy and toxicity of pentavalentantimonials (Glucantime and Pentostam) in an American cutaneous leishmaniasis animal model: luminometry application. Biomédica. 24, 393-402 (2004).
  7. Travi, B. L., Martinez, J. E., Zea, A. Antimonial treatment of hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis: assessment of parasitological cure with different therapeutic schedules. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 87, 567-569 (1993).
  8. Hommel, M., jaffe, C. L., Travi, B., Milon, G. Experimental models for leishmaniasis and for testing anti-leishmanial vaccines. Ann. Trop. Med. Parasitol. 89, 55-73 (1995).
  9. Travi, B. L., Osorio, Y., Saravia, N. G. The inflammatory response promotes cutaneous metastasis in hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis. J. Parasitol. 82, 454-457 (1996).
  10. Travi, B. L., Osorio, Y. Failure of Albendazole as an alternative treatment of cutaneous Leishmaniasis in the hamster model. Memorias Instituto Oswaldo. 93, 515 (1998).
  11. Travi, B. L., Osorio, Y., Melby, P. C., Chandrasekar, B., Arteaga, L., Saravia, N. G. Gender is a major determinant of the clinical evolution and immune response in hamsters infected with Leishmania spp. Infect Immun. 70, 2288-2296 (2002).
  12. Osorio, Y., Melby, P. C., Pirmez, C., Chandrasekar, B., Guarín, N., Travi, B. L. The site of cutaneous infection influences the immunological response and clinical outcome of hamsters infected with Leishmania panamensis. Parasite Immunol. 25, 139-148 (2003).
  13. Osorio, Y., Bonilla, D. L., Peniche, A. G., Melby, P. C., Travi, B. L. Pregnancy enhances the innate immune response in experimental cutaneous leishmaniasis through hormone-modulated nitric oxide production. J. Leukoc. Biol. 83, 1413-1422 (2008).
  14. Espitia, C. M., Zhao, W., Saldarriaga, O., Osorio, Y., Harrison, L. M., Cappello, M., Travi, B. L., Melby, P. C. Duplex real-time reverse transcriptase PCR to determine cytokine mRNA expression in a hamster model of New World cutaneous leishmaniasis. BMC Immunol. 22, 11-31 (2010).
Kutan leishmaniasis i den dorsale hud af hamstere: en nyttig model til screening af Antileishmanial Drugs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robledo, S. M., Carrillo, L. M., Daza, A., Restrepo, A. M., Muñoz, D. L., Tobón, J., Murillo, J. D., López, A., Ríos, C., Mesa, C. V., Upegui, Y. A., Valencia-Tobón, A., Mondragón-Shem, K., RodrÍguez, B., Vélez, I. D. Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs. J. Vis. Exp. (62), e3533, doi:10.3791/3533 (2012).More

Robledo, S. M., Carrillo, L. M., Daza, A., Restrepo, A. M., Muñoz, D. L., Tobón, J., Murillo, J. D., López, A., Ríos, C., Mesa, C. V., Upegui, Y. A., Valencia-Tobón, A., Mondragón-Shem, K., RodrÍguez, B., Vélez, I. D. Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs. J. Vis. Exp. (62), e3533, doi:10.3791/3533 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter