Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

La leishmaniasis cutánea en la piel dorsal de los hámsteres: un modelo útil para la selección de fármacos antileishmania

doi: 10.3791/3533 Published: April 21, 2012

Summary

Optimización del modelo de hámster experimental para la leishmaniasis cutánea por inyección intradérmica de

Abstract

Tradicionalmente, los hámsters son inoculados experimentalmente en el hocico o la pata de la. Sin embargo, en estos sitios no siempre se produce una úlcera, la medición del tamaño de la lesión es un procedimiento difícil y animales presentan dificultad para comer, respirar y moverse a causa de la lesión. Con el fin de optimizar el modelo de hámster de la leishmaniasis cutánea, hombre adulto joven y las mujeres hámsters dorados (Mesocricetus auratus) se inyecta por vía intradérmica en la piel dorsal con 1 a 1,5 x l0 7 promastigotes de las especies de Leishmania y la progresión de las lesiones posteriores fueron evaluados durante un máximo de 16 semanas después de la infección. El hámster dorado fue elegido porque se considera adecuada la bio-modelo para evaluar los medicamentos contra la Leishmania, ya que son susceptibles a la infección por diferentes especies. La infección cutánea de los resultados de hámsters en las lesiones crónicas, pero controlada, y una evolución clínica con signos similares a los observados en seres humanos. Por lo tanto, el establecimiento of el alcance de la infección mediante la medición del tamaño de la lesión de acuerdo con el área de induraciones y úlceras es factible. Este enfoque ha demostrado su versatilidad y fácil manejo durante la inoculación, el seguimiento y la caracterización de las lesiones típicas (úlceras), la aplicación de tratamientos a través de diferentes maneras y la obtención de muestras clínicas después de los tratamientos diferentes. Mediante el uso de este método, la calidad de vida de los animales en relación con la locomoción, la búsqueda de alimentos y el agua, el juego y las actividades sociales también se conserva.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. La infección de hamsters

1. Animales

Puras hámsters dorados de ambos sexos (Mesocricetus auratus), 6-8 semanas, con un peso 140-160 g se utilizan. Están alojados en las instalaciones de los animales, en el control de temperatura de alojamiento, alimentación con comida seca estándar de roedores y siempre con agua ad libitum. Todos los procedimientos con animales han sido aprobados por el Comité de ética institucional para el uso en animales de experimentación. Antes de la infección experimental con animales dermotropic parásitos Leishmania son sexados, marcados y ponderados de acuerdo a los procedimientos estandarizados. Por determinación del sexo, los animales son inspeccionados por las características distintivas, tales como la visualización de la línea mamaria y la corta distancia ano-genital en las mujeres, o la visualización de los testículos y una distancia mayor entre el ano y el prepucio en los hombres. Entonces, los animales son marcados por la perforación del oído o por tinción de un área de la piel con una torunda empapadaen ácido pícrico. Para la perforación del oído, después de limpiar con alcohol al 70% de la oreja se perfora con un punzón el oído para los roedores. Una región con los vasos sanguíneos debe ser evitado. Sedación o anestesia con una mezcla 09:01 de ketamina (50 mg / kg) y xilacina (20 mg / kg) por vía intraperitoneal en un volumen de 260-25-G 300μl aguja se recomienda. Por último, los animales se pesan, colocándolos en una trampa o una caja que está condicionada a una balanza de precisión.

2. Parásitos

Promastigotes de las especies de Leishmania dermotropic, como L. amazonensis, se cultivan en bifásica Novy-MacNeal-Nicolle medio de cultivo (NNN) a 26 ° C. Metacíclicos (estacionario) promastigotes de fase (5 días) se utilizan para infectar a los hámsters. Brevemente, los parásitos se recogen, se lavan dos veces con tampón fosfato salino (PBS), se contaron y se ajustó a 1 x 10 7 (para los hombres) o 1,5 x 10 7 (para las hembras) parásitos en 0,1 ml de PBS para inocular macho o hembra, respectivamenteSin embargo, el tamaño de inóculo puede variar de acuerdo con la especie Leishmania (procedimiento no se muestra en el vídeo).

3. La infección experimental

Un área de la piel se afeita antes de la inoculación. Brevemente, los animales anestesiados se colocan en posición prona y el uso de tijeras, el pelo se elimina dos pulgadas de la base de la cola. Después de limpiar el área afeitada con solución salina estéril al inóculo del parásito se inyecta por vía intradérmica hasta que se forma una pápula.

4. El seguimiento clínico

Los animales son monitoreados cada 7 días hasta 4 - 6 semanas después de la inoculación para la aparición de la lesión. Poco después, los animales se inmovilizan en una trampa y el área de la piel inoculada se palpa. Entonces, el área de induración de la úlcera formada se delineadas y la anchura y la longitud de la úlcera se miden con un calibrador digital.

2. El tratamiento de los hámsteres

1. Administratración de los compuestos

El esquema de tratamiento se inicia cuando los animales han desarrollado lesiones ulceradas (4-6 semanas después de la inoculación). Los animales se distribuyen en grupos de 5-6 animales para cada compuesto a ensayar. Los compuestos se pueden administrar por vía tópica, las vías oral, intramuscular o intralesional. Antes de la aplicación de medicamentos, hámsters son anestesiados y el área de la lesión se limpia utilizando una solución salina o PBS. Cuando el compuesto se aplica vía tópica o intralesional, los hamsters se inmovilizan en trampas que permiten exponer el área a tratar, mientras que, cuando el compuesto se administra por vía oral o por vía intramuscular los hámsteres se firmemente sujeta por la base del cuello. a) La aplicación tópica: el compuesto se aplica sobre la lesión y después de pocos minutos el animal se devuelve a la jaula. b) Para la inyección intramuscular, el fármaco se inyecta (máximo de 200 l) a través de los músculos semitendinoso y semimembranoso de los cuartos traseros. c) Por vía oral administración, el fármaco se proporciona al animal (200 l máximo) a través de una sonda oro-14G gástricos conectados a una jeringa de 1 ml. d) Para la inyección intralesional de drogas (100 l máximo) es gradualmente inyecta en la base de la úlcera usando una aguja de calibre 26G con el bisel colocada hacia abajo. Toda la zona de la lesión está cubierta por la rotación de la aguja. Los tratamientos se administraron diariamente durante 10-20 días, de acuerdo con el esquema definido terapéutico.

2. El seguimiento clínico

Debido a que en este modelo experimental de la eficacia de nuevos compuestos antileishmania se determina de acuerdo con la curación y cicatrización de lesiones después del tratamiento, un seguimiento clínico de cada animal se realiza semanalmente al final de la aplicación del compuesto y hasta tres meses después. Durante el seguimiento, el tipo de lesión se describe y la induración y área de la úlcera se midió con un calibrador digital. La presencia de lesiones en regiones diferentes a la tque sitio de la inoculación, así como la aparición de recidivas de la lesión también se describe y registrado. Cada dos semanas, los animales son pesados ​​y las lesiones se imaginaba. Los animales se observan diariamente para controlar: a) aspecto físico (el pelo, la coordinación, la temperatura, los ojos, la posición de las orejas, el aseo, la defecación, la presencia de líquido ascítico, agitación y deshidratación) y b) el comportamiento (despierto, alerta, atento curioso, , se queda con el grupo, espera que los alimentos y bebidas, y difíciles de atrapar). El sitio de aplicación del compuesto también se observa la presencia de hiperemia, inflamación, y la eliminación morder y el cabello.

Los hámsteres son también sangraron a los 45 días después del final del tratamiento para determinar los valores hematológicos y serológicos que podrían estar asociados con la toxicidad de los compuestos (véase más adelante).

La efectividad de cada tratamiento se calcula comparando el tamaño de la lesión antes y después del tratamiento, con el siguiente puntaje system: curado (curación de 100% de área y la desaparición completa de la lesión); mejoría clínica (reduciendo el tamaño de la lesión en> 50% de la superficie); fracaso clínico (aumentando el tamaño de la lesión); recaída en la lesión después de la curación). Al final del estudio, los animales son sacrificados por inhalación de anestesia anterior de CO2. Después de la muerte, las muestras necesarias para los análisis parasitológicos, histológicos y serológicos se toman.

3. Exámenes parasitológicos

La presencia de Leishmania en las muestras de la piel (lesión o cicatriz), el hígado, el bazo y el riñón se determina directamente mediante el examen de frotis teñidos con Giemsa 1 y el examen histopatológico de estos tejidos (ver más abajo).

La carga parasitaria en el sitio de la lesión se estima por el ensayo de dilución límite de acuerdo a Tito y sus colegas (1985) 2. En pocas palabras, un pedazo pequeño de tejido es realoved de cada animal, se pesaron y se homogeneizaron en frío solución PBS utilizando un émbolo de la jeringa. La suspensión obtenida se centrifugó a 600 g durante 10 min a 4 ° C. A continuación, los sobrenadantes se desechan y los gránulos se resuspendieron en medio RPMI 1640 suplementado con antibióticos 1% y 10% de suero fetal de ternero. A l cien de la suspensión son transferidas a cada uno de los 96 pocillos a la placa de microtitulación que contiene superpuesto medio NNN con 50 l de Schneider medio y se mantuvo a 26 ° C. El número de parásitos viables en cada muestra se determinó a partir de la dilución más alta a la que promastigotos podría ser detectado mediante el examen bajo un microscopio invertido cada semana durante un mes.

4. El examen histopatológico de la lesión de la piel (o de la cicatriz) y otros tejidos

Una tercera pieza de la muestra de la biopsia tomada de la piel, el hígado y el riñón se fija en el 10% de formalina y embebidos en parafina. De la pieza de bazo y el corazón también podría ser processed. Cinco secciones micras de los tejidos fijados se tiñeron con haemotoxilin-eosina y se examina bajo un microscopio óptico utilizando 200X, 400X o aceite de inmersión 1000X para estudiar la arquitectura micro, las características del infiltrado celular, y la presencia o ausencia de parásitos. Las microfotografías se toman y se capturaron imágenes digitales.

5. Evaluación de la toxicidad del tratamiento

Actividad tóxica del compuesto se basa en la condición física y el comportamiento de los animales de acuerdo con los parámetros controlados durante el seguimiento clínico (véase más arriba). Toxicidad también se determinó de acuerdo con los parámetros hematológicos y metabólicos en muestras de sangre y los cambios histopatológicos observados en secciones de tejidos teñidos con haemotoxilin-eosina como se describió anteriormente.

Las muestras de sangre se toman desde el corazón, preferiblemente el ventrículo. Para la prueba hematológica, la sangre se transfirió a tubos con EDTA anticoagulados y procesado de la cadena AccorDing para estandarizar los protocolos para el recuento sanguíneo completo. Para las pruebas serológicas, la sangre se transfiere a 1,5 viales de Eppendorf y se centrifugó para obtener el suero para el análisis metabólico de los niveles de creatinina, ALT y BUN midió utilizando Kodak Ektachemdry química 3.

6. Análisis de los datos

Los datos de los animales tratados y no tratados se compararon mediante la prueba ANOVA. La significación se fijó en p <0,05.

3. Los resultados representativos

Resumen

El modelo de hámster de la leishmaniasis cutánea se ha mejorado con el objetivo de utilizar este modelo en la detección de drogas eficacia. Desarrollo de la lesión y los parámetros parasitológicos fueron estudiados durante la infección primaria en la piel cutánea de los hámsters. Puras hámsters dorados de ambos sexos (Mesocricetus auratus), 6-8 semanas, se inyecta por vía intradérmica con 1 x 10 7 (para los hombres) o 1,5 x 10 7 (para mujeres) metacíclicos (fase estacionaria) promastigotes de L. amazonensis. Los nódulos aparecieron 20 - 35 días pi, con úlceras que forman después de 4-6 semanas PI después de la infección se estableció, la eficacia de antimonio pentavalente (SBV) en dos dosis se evaluó. Los hámsters fueron distribuidos aleatoriamente en tres grupos de 5 animales cada uno y se trata con antimoniato de meglumina a 80 o 120 mg SbV / kg al día durante 10 días, por vía intramuscular. El tercer grupo fue tratado por vía intramuscular con PBS como placebo. Un grupo de tres animales se dejaron sin tratar y se utiliza como un control negativo. La respuesta a cada tratamiento fue seguido hasta 3 meses después del final del período de tratamiento.

1. La evolución clínica después de la L. amazonensis infección del hámster dorado (Mesocricetus auratus)

Los hámsters infectados en la piel dorsal desarrolla constantemente la ulceración clínicamente evidente de la epidermis a las 4-6 semanas después de la infección. Las lesiones comienzan con pequeños nódulos y úlceras que terminanque aumentan de tamaño en función del tiempo después de la infección y llegar a lo que se consideraba un tamaño óptimo para la evaluación del efecto de fármacos experimentales por la cuarta a sexta semana después de la infección (18,99 a 54,7 mm de 2 a 4 semanas y 35,55 a 92,71 mm de 2 a 6 semanas) (Figuras 1, 2). Las lesiones posteriormente mantuvo una úlcera evidente para un máximo de 20 semanas después de la infección, en cuyo momento los experimentos se terminaron (Figura 1).

La infección por L. amazonensis no afecta al peso corporal de los hámsters que varía de 104,9 a 124,69 gr y 129,71 a 134,02 gr en hámsters infectados e infectados, respectivamente (p> 0.05, ANOVA). Los animales aumentaron un promedio de 25.58 ± 5,98% del peso corporal durante el estudio. Los valores séricos de creatinina y alanina parámetros aminotransferasa (ALT) y el hemograma fueron similares a los valores de referencia en hámsters infectados y no infectados por Leishmania. Only la urea pan de nitrógeno (BUN) fue aumentada en un 60% de los animales infectados.

El análisis histopatológico de las lesiones en los hámsteres infectados con L. amazonensis mostraron diferencias relacionadas con los animales no infectados. En general, las biopsias de piel de hámsteres infectados no muestran ninguna reacción inflamatoria o cualquier alteración histológica (Figura 3a), mientras que los infectados con L. amazonensis desarrollar una dermatitis granulomatosa y abundante presencia de macrófagos que infiltran la dermis (Figura 3b). El análisis histopatológico de los tejidos de hámsters infectados con L. amazonensis y se trató con antimoniato de meglumina en dosis de 80 y 120 mg SbV / kg / día durante 10 días mostró cambios asociados con el proceso de infección similares a los observados en el grupo control (infectado y no tratado). En general, las muestras de piel de hámsteres mostró un ligero nivel de plasmocitos (20%) y PMN (80%) acompañado por células moderadainfiltración de linfocitos (80%), y una leve (20%) o grave (80%) de infiltración de macrófagos (Tabla 2). Estas observaciones se corresponden con un diagnóstico de la dermatitis granulomatosa, un evento inflamatorio que compromete la dermis y el músculo subyacente. Esta es la lesión principal asociado a la infección, que es compatible con la manifestación grave de la leishmaniasis cutánea en todos los animales en el estudio. Esta asociación se correlacionó estadísticamente cuando el Chi-cuadrado de Pearson, que arrojó p <0,05 Muestras renales de 60-100% de los animales mostró hiperplasia moderada en la corteza renal y glomérulos acompañados por una atrofia leve de los riñones en el 75% de los animales. Estas observaciones son compatibles con glomerulonefritis membranoproliferativa, un diagnóstico que ha sido previamente asociada a la infección por la infección por otras especies de Leishmania. La asociación estadística era grande, con una chi-cuadrado de Pearson, p <0,05. Los hígados de 40-100% de untrado animales seropositivos en todos los grupos mostraron ligeros cambios vacuolares en los hepatocitos, las cuales pueden estar asociados a los procesos fisiológicos tales como la acumulación de glucógeno hepatocitos. Otras anomalías del tejido del hígado, tales como la degeneración grasa, fibrosis, y la congestión se corresponden con el proceso de infección. Otras observaciones, tales como cambios vacuolares en los hepatocitos, cardiomegalies, la presencia de inclusiones de eosinófilos intracitoplasmáticos, así como la vacuolización de células en los tubos renales no se asocia estadísticamente (p> 0,05) a un efecto tóxico del compuesto ensayado y es probable debido a un proceso fisiológico en los hámsters.

2. La eficacia terapéutica del antimoniato de meglumina en el modelo de hámster

El fenotipo clínico de los hámsters infectados en diferentes puntos temporales después del tratamiento se resume en la Tabla 1. El tratamiento con antimoniato de meglumina intramuscular a una dosis de 120 mg SbV / kg / día durante 10 días peso erainductor altamente eficaz regresión completa de la L. lesiones amazonensis en todos los animales (Figura 4). El porcentaje de curación fue del 100% dentro de la 2 y 8 semanas período post-tratamiento. Sin embargo, después de tres meses, la recaída de la lesión se observó en 20% de hámsters. Cuando antimoniato de meglumina se administró a 80 mg de peso corporal SbV / kg, la curación completa sólo se observó en 3 animales. En los otros dos animales de la lesión disminuyó un 33,9% y 69,0, respectivamente (Figura 5). Después de tres meses, L. amazonensis se mantuvo presente en la piel de todos los animales tratados con antimoniato de meglumina en una dosis de 80 mg SbV / kg / día y sólo uno de los animales tratados con 120 mg SbV / kg / día de antimoniato de meglumina. Una dosis curativa de intramuscular 120 mg SbV / kg / día durante 10 días se determinó.

Usando el ensayo de dilución límite, el número estimado de los parásitos mostraron una reducción significativa en el grupo tratado con MegLumine antimoniato en comparación con los negativos (sin tratar) el control y el vehículo (placebo) grupo tratado (p <0,001). Parásitos viables (0,4 a 1,6 parásitos por mg de tejido de la piel) se detectaron en el sitio de la lesión de los animales no tratados y los tratados con PBS. Los parásitos fueron aislados sólo de aquellos animales que no respondieron al tratamiento con antimoniato de meglumina: uno de los animales tratados con 120 mg / kg / día (Figura 5b) y dos hámsteres tratados con 80 mg / kg / día (Figura 5c). No hay diferencia se observa en la carga parasitaria de hámsters que no curan después de recibir meglumina antimonite en comparación con los animales no tratados o tratados con PBS.

En el estudio histopatológico de las biopsias de piel de hámsteres tratados con antimoniato de meglumina intramuscular de 120 mg SbV / kg / día no se observan los parásitos, los macrófagos y linfocitos que infiltran la dermis se ven (Figura 6a, 6b). Al contrario, cuando los hámsteres sere tratamiento con antimoniato de meglumina a 80 mg SbV / kg / día, dermatitis granulomatosa con abundante presencia de macrófagos infiltran la dermis se observa ampliamente (Figura 6c, 6d).

3. Toxicidad

Utilizando el mismo esquema terapéutico para estudio de eficacia, la toxicidad de antimoniato de meglumina en 80 y 120 mg de peso corporal SbV / kg se evaluó. Estado general de salud y el peso corporal fueron monitoreados hasta 3 meses después de la última dosis. El tratamiento con no afectó el peso corporal de los hámsters que varía de 104,9 a 124,69 gr y 129,71 a 134,02 gr en hámsters infectados e infectados, respectivamente. Los animales aumentaron un promedio de 27,59 ± 4,22% del peso corporal durante el tratamiento y 28,74 ± 2,26% durante el seguimiento (p> 0.05, ANOVA). La pérdida de peso no se observó en cualquier grupo de tratamiento (datos no mostrados). Los valores séricos de creatinina y alanina parámetros aminotransferasa (ALT) y el hemogramafueron similares a los valores de las referencias que en no tratados y tratados antimoniato de meglumina hámsters. Sólo la urea pan de nitrógeno (BUN) fue aumentada en un 20% de los animales tratados.

El análisis histopatológico de los tejidos de hámsters infectados con L. amazonensis y se trató con antimoniato de meglumina en dosis de 80 y 120 mg SbV / kg / día durante 10 días no mostraron cambios asociados a la toxicidad del fármaco.

Tabla 1
un tampón fosfato salino, días después del tratamiento b.
Tabla 1. Fenotipo clínico de la L. amazonensis hámsters infectados experimentalmente después del tratamiento con antimoniato de meglumina.

La efectividad de cada tratamiento se calcula comparando el tamaño de la lesión antes y después del tratamiento, utilizando el sistema de puntuación siguiente: curación (curación del 100% de la superficie y la desaparición completa de la lesión); Mejoría clínica (reduciendo el tamaño de la lesión en> 50% de la superficie); fracaso clínico (aumentando el tamaño de la lesión); recaída (reactivación de la lesión después del curado).

Tabla 2
R: signo ausente; NA: no aplicable; m: leve, M: moderado; S: severa; PMN: polimorfonucleares neutrófilos; Ley de Seguridad Nacional: No hay lesión significativa; GDM: dermatomiositis granulomatosa; DGP: dermatitis piogranulomatosa. 1. Lymphangiectasia; 2. Minerales como el material.
Tabla 2. Histopatología de la piel de hámsters infectados experimentalmente con L. amazonensis y tratados con antimoniato de meglumina.

Figura 1
Figura 1. Curso de desarrollo de lesión de la piel después de la infección en los hámsteres inoculados por vía intradérmica con 1 a 1,5 x 10 7 L. amazonensis metacíclicos (stationa ry fase) promastigotos durante 20 semanas. Eje y representa el área de la úlcera en mm.

Figura 2
Figura 2. La historia Photographyic de desarrollo de las lesiones ulcerosas en la piel dorsal de un hámster dorado después de la inoculación intradérmica de 10 x 10 7 a las 2 semanas (a), 4 semanas (b) y 6 semanas (c).

Figura 3
Figura 3 Biopsia de piel a partir de (un) hámster no infectadas y no tratadas. Ninguna reacción inflamatoria ni alteración significativa histológico se observa, (b) infectados y no tratados hámster: dermatitis granulomatosa con presencia de células gigantes multinucleadas (flecha más asterisco) y parásitos abundantes (negro flechas) y los macrófagos (flechas blancas) la infiltración de la dermis. Hematoxilina-eosina 400x manchas.

volver 4 "/>
La historia de la Figura 4. Fotográfica de la respuesta clínica de los hámsteres infectados con L. amazonensis y tratados con antimoniato de meglumina intramuscular de 120 mg SbV / kg / día durante 10 días. Las imágenes muestran el aspecto de la lesión antes del tratamiento (a), al final del tratamiento (día 10) (b), y durante el seguimiento: día 30 (c), 60 (d) y 90 (e) después tratamiento.

Figura 5
Figura 5. Eficacia de antimoniato de meglumina en el tratamiento de la leishmaniasis cutánea en el hámster. Hámsters dorados fueron infectados con L. amazonensis en la piel dorsal. Después de 6 semanas de la infección que se dejaron sin tratar (a) o tratadas por vía intramuscular durante diez días con PBS solo (b), meglumina antimoniato de 120 mg SbV / kg / día (c) o 80 mg SbV / kg / día (d). Los gráficos muestran el porcentaje de disminución en el tamaño de la lesión al final del tratamiento (día 0), y, al día 15, 3060 y 90 de seguimiento después del final del tratamiento. p <0,001 para 120 o 80 mg SbV / kg / día vs vehículo y no el tratamiento.

Figura 6
Figura 6. Piel biopsia de hámsteres infectados y se trató con intramuscular antinmoniate megumine a 120 mg SbV / kg / día (a, b) y 80 mg SbV / kg / día (c, d). La presencia de macrófagos y linfocitos infiltrantes escasos de la dermis. No se observan parásitos. Hematoxilina-eosina 200x (a), 1000x (c) la dermatitis granulomatosa con abundante presencia de macrófagos infiltran la dermis ampliamente (c);. Macrófagos espumosos con parásitos fagocitados. Hematoxilina-eosina 200x (b), 1000x (d).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La leishmaniasis cutánea es endémica en los trópicos y el Neotrópico. Se refiere a menudo como un grupo de enfermedades debido a la variada gama de manifestaciones clínicas, que van desde pequeños nódulos cutáneos a la destrucción bruta tejido mucoso. Mayoría de los fármacos disponibles son costosas, requieren tratamientos largos de tratamiento y se están convirtiendo cada vez más ineficaz, lo que exige el descubrimiento de nuevos fármacos.

El modelo de ratón se utiliza ampliamente, pero tiene algunas desventajas. Así, por ejemplo, sobre la base de la lesión que se desarrolló después de la inyección intradérmica de promastigotes de dermotropic especies de Leishmania, los ratones se puede dividir en tres grupos: uno altamente susceptibles a la infección persistente caracterizado por una lesión ulcerosa en expansión como se ve en ratones BALB / cy DBA / 2, DBA / 3 los ratones, un grupo relativamente resistentes donde las lesiones pueden resolverse dentro de 8 semanas como se ve en CBA / H, C3H/He y A / J y un grupo de alta resistencia en la que no existe un verdadero lesión típicamentecal de la leishmaniasis cutánea se desarrolla en la inyección como se ve en NZB y C57BL / 4 6 ratones. En contraste con el modelo murino de leishmaniasis cutánea donde el curso de la enfermedad varió notablemente entre diferentes cepas comunes de ratones consanguíneos y especies de Leishmania, el hámster dorado, Mesocricetus auratus se considera adecuada la bio-modelo para evaluar fármacos contra especies de Leishmania, ya que son susceptibles a la infección por diferentes especies de Leishmania. 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14. La inoculación de metacíclicos (fase estacionaria) promastigotes de cualquiera de las especies de Leishmania dermotropic es capaz de provocar lesiones cutáneas entre uno y dos meses después de la inoculación. Las lesiones se hacen evidentes los 20 días pi como pápulas, que evolucionaron a los nódulos y más tarde, a las úlceras. Dependiendo del sitio de la inoculación (PE hocico, foodpad, el oído o la base de la cola) el hámster muestra una evolución de la enfermedad predecible después de la infección experimental, la mayoría de THelectrónico en tiempo caracterizado por el desarrollo de una crónica lesión ulcerada local similar a los observados en seres humanos con leishmaniasis cutánea. Sin embargo, como en los seres humanos, las lesiones varió en tamaños dependiendo del estado inmune de cada individuo y por lo tanto, en algunos hámsteres un intento de resolver la lesión y, por consiguiente reducción del tamaño de la lesión puede ser visto.

Aunque este artículo se describe la infección experimental en la piel dorsal de los hámsters con promastigotes de L. amazonesis, este modelo también es factible que otras especies de Leishmania dermotropic, cambiando sólo el tamaño del inóculo. En resumen, el enfoque de la inyección intradérmica de promastigotes en la piel dorsal demuestra que las características clínicas y patológicas de la leishmaniasis cutánea inducida en la piel dorsal de los hámsters son muy similares a la enfermedad humana. Además, el seguimiento clínico de las úlceras después del tratamiento con compuestos específicos o dalfombras se facilita en este modelo de CL inducida en la piel dorsal. La evolución de las lesiones se determina fácilmente mediante la comparación del tamaño de la lesión obtenido antes y después del tratamiento. La respuesta clínica en términos de curación es fácilmente seguido de acuerdo con la re-epitelización (como se ve en la Figura 4). Se concluye que la infección experimental en la piel dorsal de hamsters con especies de Leishmania representa un modelo útil para validar el potencial de los compuestos que son candidatos a fármacos antileishmania.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por becas de la Comisión de Investigación de la Universidad de Antioquia (CODI), el Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología - COLCIENCIAS y el Centro para el Desarrollo de Productos contra las Enfermedades Tropicales - CIDEPRO.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Ketamine Reagent Holliday –Scott S.A
Xilacine Reagent Synthesis
PBS Reagent GIBCO, by Life Technologies 14190-136
Digital caliper Equipment Fisher Scientific 15-077-958
Giemsa Reagent Sigma-Aldrich GS1L-1L
Formalin Reagent Nova lab 11273
Paraffin Reagent Pechiney Plastic Packaging PM-996
Haemotoxilin Reagent Nova lab 10870103
Eosin Nova lab 10870203
Kodak Ektachem dry chemistry Equipment Kodak Ektachem DT-60
meglumine antimoniate Reagent Aventis
Microscopy Equipment Nikon Instruments YS2-T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Control of the leishmaniasis. Report of a Meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis WHO. 949, (2010).
  2. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunol. 7, 545-555 (1985).
  3. Reynolds, K. M. The Kodak Ektachem dry layer technology for clinical chemistry. Upsala. J. Med. Sci. 91, 143-146 (1986).
  4. Handman, E., Ceredig, R., Mitchell, G. F. Murine cutaneous leishmaniasis: disease patterns in intact and nude mice of various genotypes and examination of some differences between normal and infected macrophages. Australian J. Exp. Biol. Med. Sci. 57, 9-29 (1979).
  5. Hanson, W., Chapman, W., Waits, V., Lovelace, J. Development of Leishmania (Viannia) panamensis lesions and relationship of numbers of amastigotes to lesion area antimony-treated and untreated hamsters. J. Parasitol. 77, 780-783 (1991).
  6. Henao, H. H., Osorio, Y., Saravia, N. G., Gómez, A., Travi, B. Efficacy and toxicity of pentavalentantimonials (Glucantime and Pentostam) in an American cutaneous leishmaniasis animal model: luminometry application. Biomédica. 24, 393-402 (2004).
  7. Travi, B. L., Martinez, J. E., Zea, A. Antimonial treatment of hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis: assessment of parasitological cure with different therapeutic schedules. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 87, 567-569 (1993).
  8. Hommel, M., jaffe, C. L., Travi, B., Milon, G. Experimental models for leishmaniasis and for testing anti-leishmanial vaccines. Ann. Trop. Med. Parasitol. 89, 55-73 (1995).
  9. Travi, B. L., Osorio, Y., Saravia, N. G. The inflammatory response promotes cutaneous metastasis in hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis. J. Parasitol. 82, 454-457 (1996).
  10. Travi, B. L., Osorio, Y. Failure of Albendazole as an alternative treatment of cutaneous Leishmaniasis in the hamster model. Memorias Instituto Oswaldo. 93, 515 (1998).
  11. Travi, B. L., Osorio, Y., Melby, P. C., Chandrasekar, B., Arteaga, L., Saravia, N. G. Gender is a major determinant of the clinical evolution and immune response in hamsters infected with Leishmania spp. Infect Immun. 70, 2288-2296 (2002).
  12. Osorio, Y., Melby, P. C., Pirmez, C., Chandrasekar, B., Guarín, N., Travi, B. L. The site of cutaneous infection influences the immunological response and clinical outcome of hamsters infected with Leishmania panamensis. Parasite Immunol. 25, 139-148 (2003).
  13. Osorio, Y., Bonilla, D. L., Peniche, A. G., Melby, P. C., Travi, B. L. Pregnancy enhances the innate immune response in experimental cutaneous leishmaniasis through hormone-modulated nitric oxide production. J. Leukoc. Biol. 83, 1413-1422 (2008).
  14. Espitia, C. M., Zhao, W., Saldarriaga, O., Osorio, Y., Harrison, L. M., Cappello, M., Travi, B. L., Melby, P. C. Duplex real-time reverse transcriptase PCR to determine cytokine mRNA expression in a hamster model of New World cutaneous leishmaniasis. BMC Immunol. 22, 11-31 (2010).
La leishmaniasis cutánea en la piel dorsal de los hámsteres: un modelo útil para la selección de fármacos antileishmania
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robledo, S. M., Carrillo, L. M., Daza, A., Restrepo, A. M., Muñoz, D. L., Tobón, J., Murillo, J. D., López, A., Ríos, C., Mesa, C. V., Upegui, Y. A., Valencia-Tobón, A., Mondragón-Shem, K., RodrÍguez, B., Vélez, I. D. Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs. J. Vis. Exp. (62), e3533, doi:10.3791/3533 (2012).More

Robledo, S. M., Carrillo, L. M., Daza, A., Restrepo, A. M., Muñoz, D. L., Tobón, J., Murillo, J. D., López, A., Ríos, C., Mesa, C. V., Upegui, Y. A., Valencia-Tobón, A., Mondragón-Shem, K., RodrÍguez, B., Vélez, I. D. Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs. J. Vis. Exp. (62), e3533, doi:10.3791/3533 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter