Summary
مجموعة مباشرة إلى الأمام من الأساليب لعزل وتحديد هوية من البروتينات الأكثر وفرة وأعرب في العضلات والهيكل العظمي. ويستشف حوالي 800 البقع على هلام ثنائي الأبعاد من العضلات 10 ملغ ، وهذا يسمح لتحديد نوع الجنس تعبير البروتين. هذه الأساليب سوف تعطي نتائج تعادل في معظم الأنسجة.
Abstract
ويتحدد في المقام الأول تقلص العضلات والهيكل العظمي الإجمالي في عدد صغير نسبيا من البروتينات مقلص ، ولكن هذا النسيج هو أيضا قابل للتكيف بشكل ملحوظ إلى عوامل بيئية مثل تضخم 1 التي تمارس المقاومة وضمور بواسطة الترك. وبالتالي فإنه يسلك إعادة عرض والتكيف مع الضغوطات (الحرارة ، ونقص التروية ، والمعادن الثقيلة ، الخ.) 2،3. يمكن أن يحدث ضرر لعضلة من قبل قوة العضلات في حين تبذل التطويل ، ما يسمى ب 4 انكماش غريب الأطوار. يمكن أن تتلف البروتينات مقلص في مثل الاجهاد وتحتاج إلى إصلاح ، المتردية و / أو resynthesized ، وهذه المهام ليست جزءا من البروتينات مقلص ، ولكن من البروتينات الأخرى أقل توافرا في الخلية. لتحديد ما ينطوي فرعية من البروتينات في تحسين هذا النوع من الضرر ، لا بد من إنشاء بروتيوم العالمية قبل التمرين 5 ثم تبعها بعد ذلك إلى ممارسة لتحديد الفرقتعبير البروتين وبالتالي تسليط الضوء على البروتينات مرشح في التكيف مع الأضرار وإصلاحها. وعلاوة على ذلك ، أجريت معظم الدراسات من الهيكل العظمي والعضلات على الذكور من الأنواع ، وبالتالي قد لا تكون ممثلة للعضلة الإناث.
في هذه المقالة نقدم طريقة لاستخراج البروتينات بتكاثر من عضلات الذكور والإناث ، والتي تفصلها عن طريق الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد تليها عالية التصوير الرقمي القرار 6. وهذا يوفر بروتوكول للبقع (والبروتينات التي تم تحديدها لاحقا) التي تظهر إحصائيا (P <0.05) شقين زيادة أو نقصان ، تظهر أو تختفي من سيطرة الدولة. ثم يتم استئصال هذه ، ويتفاعل مع التربسين ومفصولة اللوني السائل ذات الضغط العالي بالإضافة إلى مطياف الكتلة (LC / MS) لتحديد البروتين (LC / MS / MS) 5. ويمكن استخدام هذه المنهجية (الشكل 1) في العديد من الأنسجة مع قليل من دون تعديل (الكبد والمخ ، والاستماعر الخ).
Protocol
1. إعداد نموذج
- استخدام الطازجة والمجمدة الأنسجة فلاش أو RNAlater المعاملة بدءا من الفئران والمادية. وصمة عار بعيدا أي حافظة الزائدة مع Kimwipe قبل المتابعة.
- إزالة جميع الأوتار واللفافة حول العضلات والأنسجة مع اللحم المفروم واحد شفرات الحلاقة ارتفعت لمدة 2 دقيقة على لوحات زجاجية مبردة في غرفة باردة (4 درجة مئوية) حتى الأنسجة المفروم جيدا أو مساحيق. جمع العينة في أنبوب قبل microfuge وتحديد وزنه وزن الأنسجة. استخدام ما لا يزيد عن 10 ملغ من النسيج كمادة البداية.
- إضافة العازلة استخراج 45 ميكرولتر (8 م اليوريا ، و 50 ملي DTT ، الفصلان 4 ٪ ، 0.2 ٪ ampholytes الناقل 08/05 ، 0.0002 ٪ زرقة البروموفينول) في الأنسجة 1 ملغ مفروم ، في درجة حرارة الغرفة. إذا كان حجم أكبر من 350 ميكرولتر ، إضافة 350 ميكروليتر في البداية والتجانس (الخطوة 1.4) ، ثم تضاف بقية عازلة لتقليل الرش.
- تجانس الأنسجة سبع مرات مع مدقة بمحركات (Kontes كورب) لمدة 15 ثانية في4 درجات مئوية ، مع اثنين من دقيقة التبريد على الجليد بين كل التجانس.
- الطرد المركزي في العينات 15600 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. حفظ طاف وقياس حجمها. يتم تجاهل الخلية بيليه الحطام.
- ترسيب البروتينات في طاف مع الثلج الباردة الأسيتون كاشف الصف (3 مرات الخامس : V نسبة). دوامة الأنابيب لمدة 15 ثانية. الطرد المركزي ل15600 x ج لمدة 10 ثانية لتشكيل الكريات ، وresuspend في استخراج العازلة مع المحرك Kontes وقضبان البولي بروبلين التحريك (BioSpec برود)
- كرر 1.6 الخطوة.
- إما المضي قدما مع تقدير تركيز البروتين في عينات أو تخزينها في -20 درجة مئوية.
2. تركيز البروتين تقدير
استخدام مقايسة لوري 7 أو 8 مقايسة BCA (بيرس) ، تهدف لنحو 4.5 -1 مل ملغ.
3. تركز كهرساوي
- إزالة الشريط IPG ReadyStrip (11 سم ، ودرجة الحموضة 5-8 ، بيو راد)من -20 درجة مئوية ، والسماح لها لكي تتوازن في RT لمدة 10-15 دقيقة.
- دوامة العينة وماصة 600-800 ميكروغرام (الحجم الكلي 200 ميكرولتر) من عينة البروتين في خط مستقيم على الحافة الخلفية للقناة في العينة علبة الإماهة ، وترك حوالي 1 سم في كل نهاية.
- باستخدام ملقط ، انزع غطاء من البلاستيك الشريط IPG -- التأكد من معالجة سوى طرفي الشريط وتجنب أي اتصال مع هلام. علما نهاية الأساسية للقطاع وضعه في الجانب الأيسر من الدرج. مكان الشريط IPG هلام الجانب السلبي على أعلى من العينة ، وتجنب فقاعات محاصرة تحتها. السماح لها ترطيب لمدة ساعة.
- تراكب مع 2.5 مل من الزيوت المعدنية (BioRad). غطاء علبة مع الغطاء ، ويترك لترطيب خلال الليل في درجة حرارة الغرفة.
- وضع ورقة الفتيل على طرفي القناة علبة التركيز والرطب كل واحد مع 10 ميكرولتر ميليبور المياه.
- إخراج الشريط IPG عموديا وعقد لمدة 10 ثواني حول استنزاف النفط. وصمة عار ب البلاستيكacking مع Kimwipe.
- وضع الجل الشريط IPG الجانب السلبي مع نهاية الأساسية وإلى اليسار في علبة التركيز. تغطية الشريط مع 2.5 مل من الزيوت المعدنية.
- مكان الدرج في الخلية IEF متلون (بيو راد) وبرنامج بروتوكول 3 - الخطوة (الجدول 1) في درجة حرارة الخلية الافتراضي من 20 درجة مئوية ، وهو الحد الأقصى الحالي من 50 أمبير / الشريط ، والإماهة أي وقت من الأوقات.
الجهد مرة فولت ساعة المنحدر الخطوة 1 250 20 دقيقة خطي الخطوة 2 8000 2.5 ساعة خطي الخطوة 3 8000 40000 سريع مجموع 6.5 ساعة 40000 الجدول 1. ثلاث خطوات بروتوكول الخلية IEF متلون عن 11 سم IPG الشرائط.
- أخذ شرائط IPG الخروج من الخلية IEF باستخدام ملقط. وصمة عار على دعم من البلاستيك مع Kimwipe ووضع الجل الشريط IPG الجانب حتى في علبة الإماهة نظيفة. يمكنك غطاء علبة الإماهة والتفاف مع غلاف بلاستيكي وتخزينها في -- 80 درجة مئوية أو المضي قدما.
4. SDS الكهربائي هلام بولي أكريلاميد
- نقل الشريط (هلام يصل الجانب) إلى علبة موازنة الطول 11.
- إضافة 4 مل من العازلة التخفيض (6 M اليوريا و 2 ٪ SDS ، 0.05 M تريس / حمض الهيدروكلوريك 8.8 درجة الحموضة ، الجلسرين 20 ٪ ، DTT 2 ٪) إلى القناة ويوازن قطاع غزة لمدة 10 دقيقة مع اهتزاز خفيف.
- إزالة الحد العازلة ، إضافة 4 مل من ألكلة العازلة (6 M اليوريا و 2 ٪ SDS ، 0.05 M تريس / حمض الهيدروكلوريك 8.8 درجة الحموضة ، الجلسرين 20 ٪ ، 2.5 ٪ iodoacetamide) ويوازن قطاع غزة لمدة 10 دقيقة مع الهز الخفيف.
- شطف الشريط IPG بواسطة غمس يتوع لفترة وجيزة في 1 العازلة SDS X تشغيل (25 ملي تريس ، 192 ملي جليكاين ، 0.1 ٪ SDS ، ودرجة الحموضة 8.2).
- يكمن الجانب جل الشريط حتى على لوحة الخلفي من الطول 11 الفرقان مسبقة الصنع 10.5 ٪ -14 ٪ ، حمض الهيدروكلوريك تريس هلام بولي أكريلاميد SDS (بيو راد) ودفعها بلطف بحيث يجعل الاتصال الكامل مع جل SDS ؛ تأكد من أي فقاعات محاصرون بين السطوح هلام اثنين.
- تراكب الشريط IPG مع 1 مل من محلول agarose المنصهر (0.5 ٪ agarose ، 25 مم تريس ، 192 ملي جليكاين ، 0.1 ٪ SDS ، زرقة البروموفينول) والسماح للagarose يصلب لمدة 5 دقائق.
- تحميل 5 ميكرولتر من البروتين علامة 10-225 كيلو دالتون (USB ، P / N : 76740) في البئر واحدة من المعايير الوزن الجزيئي.
- تشغيل هلام العازلة في SDS (25 ملي تريس ، 192 ملي جليكاين ، 0.1 ٪ SDS ، ودرجة الحموضة 8.2) عند 200 V في درجة حرارة الغرفة أو في غرفة باردة (4 درجات مئوية) باستخدام صبغة زرقاء bromophenol الجبهة لمراقبة الهجرة الكهربائي.
- إزالة هلام من الزهر البلاستيك وصمة عار بين عشية وضحاها عن طريق هز بلطف في Coomassie بريليانت الأزرقR - 250 وصمة عار (45.5 ٪ الميثانول ، 45.5 ٪ dH2O ، وحامض الخليك 9.0 ٪ ، 0.25 ٪ Coomassie بريليانت الأزرق R - 250).
- تهز الجل في حل يزيل اللون 1 (45.5 ٪ الميثانول ، 45.5 ٪ درهم 2 O ، وحامض الخليك 9.0 ٪) مرتين لمدة 3 ساعات كل ويزيل اللون 2 (الميثانول 5 ٪ ، 90 ٪ DH 2 O ، وحامض الخليك 5 ٪) بين عشية وضحاها. تخزين في جل حامض الخليك بنسبة 7 ٪ لتحليلها.
5. هلام التصوير والتحليل
- التقاط الصور من المواد الهلامية الكمية باستخدام برنامج واحد البرامج التي تعمل على نظام التصوير VersaDoc (BioRad). المحاصيل في المناطق صورة موحدة لجميع المواد الهلامية في تجربتك.
- تحميل الصور اقتصاص على PDQuest برنامج حاسوبي 8.0 لإنشاء مجموعة التجربة. اتبع معالج الإعداد تجربة لتعريف المعلمات للكشف عن مكان وبقعة التصفح عبر الهلام. فحص وصقل بقعة مطابقة النتائج يدويا إذا لزم الأمر.
- إجراء التحليل الكمي والإحصائي للكشف عن المواد الهلامية لبقع البروتين المتطابقة مع TWس أضعاف أو أعلى فروق ذات دلالة إحصائية في التعبير بين الجماعات هلام اثنين. إنشاء مجموعة مع تحليل هذه البقع من خفض الفائدة واخراجها باستخدام قطع بقعة EXQuest (BioRad) لعملية الهضم التربسين وLC - MS - إلى تحديد البروتين.
6. في جل الهضم تريبسيني
لهذه الخطوة ، وفي تعديل بيرس جل تريبسيني كيت دايجست (# 89871X ، بيرس) يستخدم البروتوكول.
- إضافة 200 ميكروليتر من محلول destaining (25 بيكربونات الأمونيوم مم ، أسيتونتريل 50 ٪) إلى المقابس هلام. دوامة واحتضان العينات في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز. إزالة بعناية وتجاهل الحل.
- كرر الخطوة 6.1.
- إضافة 30 ميكروليتر من الطازجة العازلة الحد (50 ملي تريس [2 - carboxyethyl] الفوسفين ، بيكربونات الأمونيوم 22.5 ملم) للأنابيب تحتوي على هلام والمقابس في احتضان 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- السماح لتبريد عينات ؛ ثم إزالة وتجاهل المخزن المؤقت الحد.
- إضافة 30 ميكرولتر من ألكلة العازلة (100 iodoacetamide ملم ، 20 ملم بيكربونات الأمونيوم ، أعدت مباشرة قبل استخدامها في احباط الأنابيب الملفوفة. احتضان هذه العينات في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- إزالة وتجاهل ألكلة العازلة. غسل المقابس هلام بإضافة 200 ميكروليتر من destaining حل كل أنبوب. احتضان هذه العينات في 37 دقيقة لمدة 15 درجة مئوية.
- إزالة ورفض حل destaining وتكرار الغسيل.
- إضافة 50 ميكرولتر من أسيتونتريل إلى المقابس جل واحتضان لهم لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح لهم أن يتقلص الجافة ، ثم إزالة بعناية أسيتونتريل.
- كرر الخطوة 6.8 مرة أخرى. يجب قطع هلام تبدو بيضاء والصغيرة.
- السماح ليجف هلام القطع في Centrivap المكثف (Labconco ، الموديل EX1245) لمدة 10 دقيقة.
- تنتفخ القطع هلام بإضافة 10 ميكرولتر من محلول تنشيط التربسين (10 التربسين نانوغرام / ميكروليتر ، 25 بيكربونات الأمونيوم مم). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 مinutes.
- إضافة 25 العازلة الهضم ميكرولتر (25 بيكربونات الأمونيوم ملم) للأنابيب. احتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها مع اهتزاز.
- يصوتن العينات لمدة 10 دقيقة (برانسون ، حمام sonicator نموذج 2510) ، وتدور عليهم قبل إزالة طاف لأنبوب جديد. حفظ طاف.
- لاستخراج مزيد من الببتيدات ، إضافة 10 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ ، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز. يصوتن العينات لمدة 10 دقيقة ، وجمع وطاف طاف مع الجمع بين المحفوظة في خطوة 6.13.
7. الميكروسكيل تحلية مقتطفات الببتيد
- إزالة بيكربونات الأمونيوم والأملاح الأخرى في مقتطفات الببتيد بمساعدة C - 18 PepClean أعمدة بولداك (ThermoFisher) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- الببتيدات أزل مرتين مع أسيتونتريل ميكرولتر 20 70 ٪ ، تتبخر العينات الجافة عن طريق الطرد المركزي في Centrivap المكثف لمدة 1 ساعة وresuspendوالببتيدات في 10 ميكرولتر حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ لتحليل MS.
8. تحديد بروتين عن طريق قياس الطيف الكتلي ، إلى جانب HPLC
- فصل 5 ميكرولتر من خليط الببتيد على الأداء اللوني السائل عالية (HPLC) على مدى 40 دقيقة ، وذلك باستخدام الانحدار الخطي أسيتونتريل 20-50 ٪ مع حمض الفورميك بنسبة 0.2 ٪ على عمود PS - DVB متآلف Pepswift (Dionex) إضافة إلى أنني Nanospray على مصدر ومطياف الكتلة ايون فخ (LCQ عشاري XP ماكس فيشر الحرارية العلمي) بمعدل تدفق 400 دقيقة / NL على الحافة.
- كشف الببتيد MS1 إشارات بين 400 -- 1400 م / ض ، والسماح للقمم 3 ايون معظم مكثفة لتكون معزولة عن MS2 التسلسل بواسطة إدارة البحث الجنائي مع استبعاد الحيوية.
- لتحديد البروتين ، وتحليل النتائج من خلال البحث الببتيد الماوس Sequest قاعدة البيانات المرجعية (BioWorks البرمجيات ، والحرارية فيشر العلمية) مع تعديل السيستين الألكيلية ثابتة والتعديلات الديناميكية للالفسفرة (السيرين ، ثريونين ، التيروزين) ، methylaنشوئها (الحامض الاميني) ، والأكسدة (ميثيونين) ، ADP - ribosylation (الآرجنين) ، وأستلة N - المحطة. تطبيق معايير المطابقة المحافظة (على سبيل المثال ، لتعيين التسامح الببتيد 2 الاتحاد والتسامح 1.00 جزء والبروتينات تحتوي على ما لا يقل عن 2 الببتيدات تمرير المسؤول مقابل Xcorr تصفية الدولة [ض = 1 / س = 1.5 ، Z = 2 / س = 2.00 ، ع = 3 / س = 2.50 ، ع = 4 / س = 3.00] واحتمال P <0.05) (5) وتفتيشها يدويا MS الأطياف لتحديد البروتين واثقة.
9. ممثل النتائج :
الذكور والإناث غير ممارس ، تم استخراج الهيكل العظمي والعضلات الفئران (ذات الرأسين العضدية) وخدمتهم في خريطة ثنائية الأبعاد 5 ، المستوى الأول من العضلات النسبية بروتيوم (الشكل 2). تصور مرة واحدة عالية الدقة باستخدام التصوير الرقمي ، وتم الكشف عن بقع البروتين حوالي 800 في كل منهما. باستخدام الخريطة الذكور بروتيوم كأساس ، فإنه من الواضح أن هناك العديد من النقاط التي تتغير في وفرة في بروتيوم الإناث. شدة البقعة هي تدابير التغيير في كميات البروتين (الشكل 3). هويات من البقع البروتين الذي تغير أكثر من المثلين (صعودا أو هبوطا) ، وإحصائيا (P <0.05) مع الفئران ن = 5 ، هي التي تحدد تسلسل الحمض الأميني تحليل السائل باستخدام الطيف الكتلي اللوني جانب. هذه النتائج تبين أن الإناث تدل على وجود انخفاض في الإنزيمات وفرة الطاقة واستقلاب السكر في كيناز الكرياتين الأشكال الإسوية (CK) الانزيم ، وإمدادات الطاقة المختلفة في نظام العضلات. كل من البشر والحيوانات عرض أعلى مستويات مصل الذكور CK في الراحة والتمرين التالي 9،10 ، ولكن مستويات مصل CK لا تتطابق بالضرورة مع مقدار من الاضطراب myofibrillar 11،12. هذه مثنوية الشكل بين الجنسين في وفرة من CK الخلوية في الفئران العضلة ذات الرأسين العضدية هي رواية finding5 وربما الإجابة على مختلف المستويات CK فيزيولوجيا المصل.
الأرقام :
g1.jpg "/>
الشكل 1. إن التخطيطي الشامل لبروتوكول لالبروتيوميات نسبية. وينقسم البروتوكول إلى ثلاث مجموعات : إعداد العينات ، وتحليل عينة ، وتحديد البروتين. تنتهي كل من هذه المجموعات الثلاث من البروتوكولات هي أيضا معقولة أماكن التوقف ، على الرغم من حصل على أفضل النتائج إذا تم تنفيذ بروتوكول العام من دون توقف.
الشكل 2. مقارنة بين الإناث الفئران البروتين ذات الرأسين العضدية البقع بالنسبة لبقع مماثلة في ذات الرأسين العضدية الذكور (الدوائر الخضراء س). وحلقت البقع التي زادت أكبر من أو يساوي بين ضعفين في الإناث الحمراء (س) ، وحلقت تلك التي انخفضت أقل من أو يساوي بين ضعفين الأزرق (س).
الشكل 3 تحليل كثافة جل سبوت : المحور السيني ، الإناثقبل التمرين (السيطرة ، ن = 5) ؛ Y محور واحد الإناث نوبة 0 ساعة الوقت نقطة المجموعة (ن = 5). خط الانحدار : معامل الارتباط = 0،919 ؛ المنحدر = 0.976 ؛ اعتراض = -0.0293. النقاط فوق وتحت الخط الاحمر الخط الازرق تغيير أكثر من + / -- شقين.
Discussion
الأسلوب البروتيوميات LC / MS المقدمة هنا هو بروتوكول الأكثر موثوقية وقابلة للتكرار لإجراء تحليل سريع لمستوى الأول للبروتيوم العضلات والهيكل العظمي. فإنه يسمح للمقارنة وسيلة معقولة من الدقة بين الجنسين. والبروتينات وفرة منخفضة تتطلب تجزيء عينة العضلات لإزالة أكبر عدد ممكن من البروتينات مقلص وقت ممكن ، وبالتالي زيادة وفرة البروتينات منخفضة. ويمكن تفصيل ملف بروتيوم أن يتحقق مع اختلاف شرائح الأس الهيدروجيني IPG نطاق والمواد الهلامية بديل نسبة الانحدار اذا شئت. البقع الفلورسنت أكثر حساسية موجودة ، ولكن من المستحسن أن كل مختبر تحديد الخطي من هذه البقع في النظام. لمزيد من التحليل الدقيق لتعبير البروتين نظام DIGE (ثنائي الأبعاد في النظام الكهربائي ، جل ، وجنرال الكتريك للرعاية الصحية علوم الحياة) يمكن استخدامها ، ولكن هذا لا تضيف مستوى من التعقيد إلى المنهجية. كذلك ، يمكن استخدام بروتوكول الموصوفة هنا مع معظم العانيسوء الأنسجة التي تم تسلسل الجينوم ، فضلا عن التسلسل دي نوفو من البروتين من أي مصدر ، ما دام يمكن أن تحل على هلام ثنائي الأبعاد ، حيث يمكن أن تتولد شظايا الأنزيمية تداخل باستخدام أنزيمات عالية النقاء بالإضافة لالتربسين. قد عينات الأنسجة من مصادر أخرى تتطلب بعض التعديلات في منهجية الاستخراج ، وخصوصا اذا يبحث عن بروتينات الغشاء ومسعور ، ومع ذلك ، كانت لدينا نتائج جيدة باستخدام هذا البروتوكول مع القلب والكبد والكلى وأنسجة المخ. قد يتم الكشف عن الأخرى في مرحلة ما بعد متعدية التعديلات عن طريق تعديل قاعدة بيانات الطيف معايير البحث الشامل. باختصار ، لقد قدمنا بروتوكول مفصلة معقول الأولية لتحليل التنميط بروتيوم.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر يوتيان غان لاستخدام الشكل 3. وأيد هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم 0420971 ، وكلية سميث Blakeslee ، Wilens هولمز والصناديق ، ومعهد هوارد هيوز الطبي.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PepClean C-18 Spin Columns | Consumable | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PI-89870 | |
| Pepswift monolithic column (100um x 5 cm) | Consumable | Dionex | 162348 | |
| Criterion pre-cast 10.5%-14% Tris-HCl SDS polyacrylamide gels | Consumable | Bio-Rad | 345-0106 | |
| Readystrip IPG strips | Consumable | Bio-Rad | Varying pH ranges | |
| Acetic acid | Reagent | Fisher Scientific | A465-1 | |
| Acetone | Reagent | Pharmco Products, Inc. | 329000 | |
| Acetonitrile | Reagent | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | Reagent | Bio-Rad | 163-2111 | Overlay solution |
| Ammonium bicarbonate | Reagent | Fluka | 40867 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | BP114 | |
| Bio-Lyte Ampholytes | Reagent | Bio-Rad | Varying pH ranges |
|
| CHAPS | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 13361 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20278 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 15395 | |
| Formic acid | Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28905 | |
| Glycerol | Reagent | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Glycine | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 16407 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Methanol | Reagent | Fisher Scientific | A452 | |
| Mineral oil | Reagent | Bio-Rad | 163-2129 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Tris base | Reagent | Sigma-Aldrich | 93349 | |
| Tris[2-carb–xyethyl] phosphine | Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 77720 | |
| Trypsin Endoproteinase, TPCK treated, MS grade | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 90055 | modified |
| Urea | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 75826 | |
| Water | Reagent | Burdick & Jackson | 365 | |
| Centrivap Concentrator | Tool | Labconco Corp. | ||
| Exquest spot cutter | Tool | Bio-Rad | ||
| LCQ Deca XP Max ion trap mass spectrometer | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Motorized pestle | Tool | Kontes Corp | ||
| Polypropylene stirring | Tool | Biospec Products | ||
| rods | ||||
| PROTEAN IEF cell | Tool | Bio-Rad | ||
| Sonicator | Tool | Branson | ||
| Surveyor Plus HPLC system | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| VersaDoc imaging system | Tool | Bio-Rad |
References
- Fehrenbach, E. Molecular and Cellular Exercise Physiology. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 199-217 (2005).
- Mooren, F. C.
- Thompson, H. S., Clarkson, P. M., Scordilis, S. P. The repeated bout effect and heat shock proteins: intra-muscular HSP27 and HSP70 expression following two bouts of eccentric exercise in humans. Acta. Physiol. Scand. 174, 47-56 (2002).
- McHugh, M. P. Recent advances in the understanding of the repeated bout effect: the protective effect against muscle damage from a single bout of eccentric exercise. Scand. J. Med. Sci. Sports. 13, 88-97 (2003).
- Metskas, L. A., Kulp, M., Scordilis, S. P. Gender Dimorphism in the Exercise-Naïve Murine Skeletal Muscle Proteome. Cell Molec. Biol. Lett. 15, 507-516 (2010).
- Lopez, J. L. Two-dimensional electrophoresis in proteome expression analysis. J. Chromatogr. B. 849, 190-202 (2007).
- Lowry, O. H., Rosenburg, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C.
- Norton, J. P., Clarkson, P. M., Graves, J. E., Litchfield, P. L., Kirwan, J. Serum creatine kinase activity and body composition in males and females. Hum. Biol. 57, 591-598 (1985).
- Amelink, G. J., Kamp, H. H., Bär, P. R. Creatine kinase isoenzyme profiles after exercise in the rat: sex-linked differences in leakage of CK-MM. Pflügers. Arch. 412, 417-421 (1988).
- Kendall, B., Eston, R. Exercise-induced muscle damage and the potential protective role of estrogen. Sports Med. 32 (2), 103-123 (2002).
- Tiidus, P. M. Can oestrogen influence skeletal muscle damage, inflammation, and repair? Br. J. Sports Med. 39, 251-253 (2005).
