Summary
分離して骨格筋に発現し、最も豊富なタンパク質の同一性を決定するための方法の直接的なセット。約800スポットが10 mgの筋から二次元ゲル上に明察しているが、これは性別特異的タンパク質の発現の判定が可能になります。これらのメソッドは、ほとんどの組織で同等の結果が得られます。
Abstract
骨格筋の総収縮は、主に収縮タンパク質の比較的小さな数によって決定されますが、この組織はまた、廃用による抵抗運動と萎縮によって肥大などの環境要因1〜非常に適応可能です。それは、それによってストレッサー（熱、虚血、重金属、 など 。）2,3に改造し、適応を示す。 、いわゆる伸張性収縮の4を長くしながら、ダメージは筋力発揮する力が筋肉に発生する可能性があります。収縮タンパク質は、そのようなexertionsに損傷や劣化及び/または再合成、修復する必要があることができ、これらの関数は、収縮タンパク質の一部ではないが、セル内の他のはるかに少ない種類のタンパク質で構成。差を決定するタンパク質のサブセットが損傷のこのタイプの改善に関与しているかを判断するには、グローバルなプロテオームは5を行使する前に確立されている必要がありますし、練習に続いて続いてタンパク質の発現と、それによって損傷とその修復の適応での候補タンパク質を強調表示します。さらに、骨格筋のほとんどの研究は、種のオスで実施されており、それ故に女性の筋肉の代表的な場合があります。
この記事では、男性と女性の筋肉から、再現性のタンパク質を抽出し、高解像度デジタル画像6で続いて二次元ゲル電気泳動によって、それらを分離する手法を提案する。これは統計的に有意（p <0.05）に2倍の増加または減少、コントロールの状態から、表示または非表示。示しスポット（およびその後のタンパク質を同定）するためのプロトコルを提供します。これらはその後、摘出トリプシンで消化し 、タンパク質同定のための質量分析計（LC / MS）（LC / MS / MS）5に結合し、高圧液体クロマトグラフィーによって分離されています。この方法論（図1）（肝臓、脳、耳のない変更がほとんどで、多くの組織で使用することができますトンなど 。）。
Protocol
1。サンプルの準備
- 出発原料としてのマウスから新鮮、瞬間凍結あるいはRNAlaterで処理した組織を使用してください。続行する前にキムワイプで余分な防腐剤を離れて覆い隠す。
- 筋肉の周りのすべての腱や筋膜を取り出して、組織がうまくみじん切りまたは粉状になるまで低温室（4℃）で冷やしたガラス板上で2分間、単一の両刃カミソリの刃で組織をミンチ。あらかじめ計量した微量遠心チューブにサンプルを収集し、組織の重量を決定する。あなたの出発原料としての組織の10以上のミリグラムを使用してください。
- 室温で、1 mgのみじん切り組織あたり45μLの抽出バッファー（8M尿素、50mMのDTT、4％CHAPS、0.2％キャリアの両性電解質5 / 8、0.0002パーセントブロモフェノールブルー）を追加します。ボリュームが350μLを超える場合は、最初に350μLを追加し（ステップ1.4）、ホモジナイズし、水はねを最小限に抑えるために、バッファの残りを加える。
- 15秒のために組織の電動乳棒（Kontesコーポレーション）で7回ホモジナイズで4℃、2分ごとに均質化の間に氷上で冷却しながら。
- 4℃で30分間15600 × gでサンプルを遠心℃に上清を保存し、その体積を測定する。細胞破片ペレットは破棄されます。
- 氷冷試薬グレードのアセトン（：V比3倍v）で上清中のタンパク質を沈殿させる。 15秒間ボルテックスチューブを。 10秒間15600 XGのための遠心ペレットを形成し、Kontesモーターとポリプロピレン攪拌棒（BioSpec PROD）で抽出緩衝液に懸濁するために
- ステップ1.6を繰り返します。
- どちらの試料のタンパク質濃度の推定を続行または-20℃で保管して
2。タンパク質濃度の推定
約4.5 mgをml -1のための目的は、ローリーアッセイ7またはBCAアッセイ8（Pierce）を使用してください。
3。等電点電気泳動
- ReadyStrip IPGストリップ（11 cmのpHを5-8、Bio - Rad）を削除する-20 ° Cから、それが10〜15分間室温で平衡化することができます。
- 渦サンプルの補水トレイ内のチャネルのバックエッジにある直線のタンパク質サンプルのサンプルやピペット600から800μgの（総体積200μL）、各端で約1cmを残して。
- IPGストリップのプラスチックカバーを剥がし、ピンセットを用いて - ストリップの端の部分だけを処理し、ゲルとの接触を避けるために確認してください。ストリップの基本的な終わりをメモし、トレイの左側に配置します。サンプルの上にIPGストリップゲル面を下に置く、下に気泡をトラップすることは避けてください。それが1時間溶解することができます。
- 2.5 mlのミネラルオイル（バイオラッド）とオーバーレイ。蓋付きのトレイをカバーし、そして室温で一晩水和するために残す。
- フォーカシングトレイのチャネルと10μLミリポア水とウェットそれぞれの両端に紙の芯を置きます。
- IPGストリップを取り出し、ドレインを約10秒間垂直に油を保持する。プラスチック製のBにしみキムワイプで肯定応答（ACK）。
- フォーカシングトレイの下と左に基本的なエンドとIPGストリップのゲル面を置きます。 2.5 mlのミネラルオイルをストリップをカバー。
- プロティアンIEFセル（Bio - Rad社）とプログラム20のデフォルトのセルの温度で3ステップのプロトコール（表1）にトレイを置く° C、50μA/ストリップ、無補水時の最大電流。
電圧が タイム 電圧時間 ランプ ステップ1 250 20分 リニア ステップ2 8000 2.5時間 リニア ステップ3 8000 4万 急速な 総 6.5時間 4万 表1。ストリップをIPGの11センチメートル用プロティアンIEFセルの三段のプロトコル。
- 鉗子を用いてIEFセルからIPGストリップを取る。キムワイプとプラスチック製のバッキングをブロットおよびクリーンな水分補給トレイにIPGストリップのゲル面を上に置きます。あなたは、水分補給トレイをカバーしてあるプラスチックのラップと店舗でそれをラップすることができます - 80 ° Cまたは進みます。
4。 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
- 11センチメートル平衡トレイにストリップ（ゲル面を上に）転送する。
- チャネルに縮小バッファ（6 M尿素、2％SDS、0.05 Mトリス/ HCl pHは8.8、20％グリセロール、2％DTT）4 mLを加え、軽度の振とうしながら10分間ストリップを平衡化します。
- 縮小バッファを削除し、アルキル化バッファー（6M尿素、2％SDS、0.05 Mトリス/ HCl pHは8.8、20％グリセロール、2.5％ヨードアセトアミド）4 mLを加え、軽度の振とうしながら10分間ストリップを平衡化します。
- STRIを浸漬することによりIPGストリップをすすぐ1 X SDSランニングバッファー（25mMトリス、192mMグリシン、0.1％SDS、pHは8.2）でpが簡単に。
- 11センチメートル基準プレキャスト10.5パーセント-14％のTris - HCl SDSポリアクリルアミドゲル（Bio - Rad社）のバックプレートにストリップのゲル面を上に置き、それをSDSゲルに完全に密着するように軽く押し込みます。に気泡が2つのゲル表面間に閉じ込めされていないことを確認してください。
- 溶融アガロース溶液の1 mL（0.5％アガロース、25mMトリス、192mMグリシン、0.1％SDS、ブロモフェノールブルー）とIPGストリップをオーバーレイし、アガロースは5分間凝固させる。
- シングルだけでなく、分子量標準に：タンパク質マーカー10から225 kDaの（76740 USB、P / N）の5μLをロードする。
- 室温で200Vでまたは電気泳動を監視するためにブロモフェノールブルー色素のフロントの移行を使用して低温室（4℃）でのSDSバッファー（25mMトリス、192mMグリシン、0.1％SDS、pHは8.2）でゲルを実行します。
- プラスチックキャストからゲルを取り出して、クマシーブリリアントブルーで穏やかに振とうして一晩染色染色R - 250（45.5％メタノール、45.5パーセントdH2O、9.0％酢酸、0.25％クマシーブリリアントブルーR - 250）。
- 3時間一晩それぞれと脱色2の（5％メタノール、90％のdH 2 O、5％酢酸）のために二度脱色1溶液（45.5％のメタノール、45.5パーセントのdH 2 O、9.0％酢酸）でゲルを振る。分析のための7％酢酸でゲルを保管してください。
5。ゲルイメージングと解析
- VersaDocイメージングシステム（BioRad）を動作する数量Oneソフトウェアプログラムを使用してゲルの画像をキャプチャ。あなたの実験ですべてのゲルの均一画像領域をトリミング。
- 実験セットを作成するPDQuest 8.0ソフトウェアのプログラム上のトリミングされた画像を読み込む。スポットの検出とゲル間マッチングスポットのパラメータを定義するために実験のセットアップウィザードに従ってください。必要に応じて手動で結果が一致する点を点検し、洗練する。
- TWと一致するタンパク質スポットを検出するためにゲルの定量的および統計的分析を実行twoゲル群間の発現のo倍以上統計的に有意な差。興味のこれらのスポットに設定された分析を作成し、トリプシン消化し、LC - MSベースのタンパク質同定のためEXQuestスポットカッター（BioRad）を用いて、それらを切り取ります。
6。ゲル内トリプシン消化
このステップのために変更されたピアースゲル内トリプシン消化キット（＃89871X、ピアース）プロトコルが使用されます。
- ゲルプラグに脱色溶液200μL（25 mM重炭酸アンモニウム、50％アセトニトリル）を追加します。渦とで37サンプルをインキュベートします振とうしながら30分間。慎重に液を除去し捨てる。
- ステップ6.1を繰り返します。
- 作りたての削減バッファー（50mM Tris [2 - カルボキシエチル]ホスフィン、22.5 mM重炭酸アンモニウム）10分間60℃でゲルプラグとインキュベーションを含むチューブに。30μLを追加
- 試料を冷却して、その後減少させるバッファを削除し、破棄する。
- アルキル化緩衝液（100mMヨードアセトアミド、20mMの重炭酸アンモニウム、アルミホイルに包まれた管で、使用直前に準備の30μLを加える。1時間室温で暗所でサンプルをインキュベートする。
- アルキル化バッファを削除し、破棄する。各チューブへのソリューションを脱色の200μLを加えることによりゲルプラグを洗浄してください。 37サンプルをインキュベート℃で15分間。
- 取り外して廃棄脱色ソリューションをして洗浄を繰り返します。
- ゲルプラグにアセトニトリル50μLを追加し、それらが乾燥収縮するために室温で10分間それらをインキュベートして、慎重にアセトニトリルを削除します。
- もう一度手順6.8を繰り返します。ゲル片は、白と小さいはずです。
- ゲル片を10分間Centrivapコンセントレータ（Labconco、モデルEX1245）で乾燥することができます。
- 活性トリプシン溶液（10 ng /μLのトリプシン、25 mM重炭酸アンモニウム）の10μLを加えることによりゲル片を膨潤。 15メートルのために室温でインキュベートinutes。
- チューブに25μLの消化緩衝液（25 mM重炭酸アンモニウム）を追加します。振盪しながら室温で一晩サンプルをインキュベートする。
- 10分間、サンプルを超音波処理（ブランソン、バスの超音波処理のモデル2510）と新しいチューブに上清を除去する前にそれらをスピンダウン。上清を保存します。
- さらにペプチドを抽出するには、振とうしながら室温で5分間0.1％ギ酸とインキュベートの10μLを加える。 、10分間サンプルを超音波処理して上清を収集し、ステップ6.13で保存した上清と組み合わせる。
7。ペプチド抽出物のマイクロ脱塩
- 重炭酸アンモニウムと製造業者の指示に従ってPepClean C - 18スピンカラム（ThermoFisher）の助けを借りて、ペプチド抽出物中の他の塩を取り外します。
- 20μLの70％アセトニトリルで2回溶出するペプチドは、1時間と再懸ためCentrivapコンセントレータで遠心分離により乾燥した試料を蒸発させるMS分析のための10μL0.1％ギ酸中のペプチド。
8。 HPLC -結合質量分析によるタンパク質同定
- PepswiftモノリシックPS - DVBコラム（ダイオネクス）に0.2％ギ酸で線形2から50パーセントのアセトニトリル勾配を用いて40分以上の高速液体クロマトグラフ（HPLC）でのペプチド混合物の別の5μLは、ナノスプレーに結合I先端で400 NL / minの流量でイオントラップ型質量分析計（LCQデカXPマックス、サーモフィッシャーサイエンティフィック）上にソース。
- 400〜ペプチドMS1信号検出 - 1400のm / zをし、動的な除外とCIDによってMS2配列決定のために分離する3最も強いイオンピークを可能にする。
- タンパク質同定のために、静的なアルキル化システイン修飾とリン酸化のための動的な変更（セリン、スレオニン、チロシン）、methylaとSEQUESTのマウスのリファレンスデータベース検索（BioWorksソフトウェア、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を介してペプチドの結果を分析る（ヒスチジン）、酸化（メチオニン）、ADP -リボシル化（アルギニン）、およびN末端アセチル化。保守的な照合基準（例えば、タンパク質はxcorrは対充電状態のフィルタを通過する少なくとも2つのペプチドを含む2 AMU及び1.00フラグメントの許容値に設定されたペプチド耐性を適用する[Z = 1 / X = 1.5、Z = 2 / X = 2.00、Z = 3 / X = 2.50、Z = 4 / X = 3.00]、pの確率<0.05）5、手動で自信を持ってタンパク質同定のためのMSスペクトルを調べる。
9。代表的な結果：
男性と女性の未行使、マウス骨格筋（上腕二頭筋）は二次元マップ5、筋肉の比較プロテオーム（図2）の最初のレベルに抽出して分離した。かつて高解像度のデジタル画像を用いて可視化、約800のタンパク質スポットは、それぞれに検出された。ベースラインとして男性のプロテオームマップを使用して、それはその女性のプロテオームにおける存在量の変化を多数の斑点があることは明らかです。スポットの強度はタンパク質量の変化（図3）の措置。 N = 5マウス持つ（アップまたはダウン）つ以上倍を変更と統計的に有意であるタンパク質スポットのアイデンティティ（P <0.05は）、液体クロマトグラフィ-共役質量分析計を用いアミノ酸配列分析によって決まります。これらの結果は、雌が砂糖のエネルギー代謝の酵素で、クレアチンキナーゼの酵素（CK）アイソフォームの存在量の減少、筋肉の別のエネルギー供給システムを実証することを示している。人間と動物の両方が残りと次の演習9,10に高雄の血清CKレベルを表示しますが、血清CKレベルは必ずしも筋原線維の崩壊11,12の量と相関関係はありません。マウス上腕二頭筋のCKの細胞の存在量のこの男女の二型性は、小説finding5であり、生理学的に異なる血清CKレベルを答えることができる。
図：
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図1比較プロテオミクスのためのプロトコルの全体的な概略図。 、サンプルの分析、および、タンパク質同定試料調製：プロトコルは3つのグループに分割されます。全体的なプロトコルは停止せずに実施されている場合、最良の結果を獲得しているものの、プロトコルのこれら3つのグループのそれぞれの両端には、また、合理的な一時停止の場所です。
図2：女性のマウス上腕二頭筋蛋白質の比較は、男性の上腕二頭筋における同一箇所（緑の円O）に対して相対的スポット。以上の女性の2倍に等しいの増加スポットは、赤色（O）の円で囲まれており、より小さいまたは2倍に等しいを減少するものは、青（O）を円で囲まれて。
図3ゲルのスポットの強度解析：X軸、メス運動前（コントロール、N = 5）、Y軸、0時間の時点の群（n = 5）試合女子シングル。回帰直線：相関係数= 0.919、傾き= 0.976、切片= -0.0293。二倍 - 赤線の上の青い線の下のスポットは、+ /以上に変更。
Discussion
ここで紹介するLC / MSプロテオミクスの方法は、骨格筋のプロテオームの最初のレベルを迅速に解析するための最も信頼性と再現性のプロトコルです。それは、ジェンダーの特異性の合理的便宜を比較することができます。低濃度のタンパク質は、筋肉のサンプルの分画は、それによって低濃度のタンパク質を増加させる、可能な限り収縮タンパク質のような多くを除去するために必要になります。必要に応じて、プロテオームプロフィールを自分好みに仕立てる異なるpH範囲のIPGストリップと代替割合の勾配ゲルで行うことができます。より多くの感受性蛍光染色は存在するが、我々は、各研究室では、システム内のこれらの汚れの直線性を決定することをお勧めします。タンパク質発現のより厳密な分析のためDIGEシステム（二次元電気泳動システム - ゲル法では、GEヘルスケアバイオサイエンス）を使用することができるが、しかし、これは方法論に複雑さのレベルを追加しません。さらに、ここに記述されたプロトコルは、ほとんどのANIを使用することができます重複する酵素断片がほかに高純度の酵素を使用して生成することができるので、ゲノムが同様に任意のソースからの蛋白質のde novoシーケンスとして、配列されている熱の組織は、限りそれは、二次元ゲル上で分離することができますトリプシンに。膜と疎水性タンパク質を探して、しかし、我々は心臓、肝臓、腎臓および脳組織では、このプロトコルを使用して良い結果を持っている場合は特に、他の組織源からのサンプルは、抽出の方法論におけるいくつかの変化が必要になる場合があります。他の翻訳後修飾は、マススペクトルデータベースの検索条件を変更することによって検出することができる。要するに、我々はプロテオームプロファイリング解析のための合理的に詳細な初期プロトコルを提示している。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は図3の使用のためYutianガンに感謝。スミスカレッジブレークスリー、Wilensとホームズの資金;、ハワードヒューズ医学研究所は、この作品は、全米科学財団0420971によってサポートされていました。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PepClean C-18 Spin Columns | Consumable | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PI-89870 | |
| Pepswift monolithic column (100um x 5 cm) | Consumable | Dionex | 162348 | |
| Criterion pre-cast 10.5%-14% Tris-HCl SDS polyacrylamide gels | Consumable | Bio-Rad | 345-0106 | |
| Readystrip IPG strips | Consumable | Bio-Rad | Varying pH ranges | |
| Acetic acid | Reagent | Fisher Scientific | A465-1 | |
| Acetone | Reagent | Pharmco Products, Inc. | 329000 | |
| Acetonitrile | Reagent | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | Reagent | Bio-Rad | 163-2111 | Overlay solution |
| Ammonium bicarbonate | Reagent | Fluka | 40867 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | BP114 | |
| Bio-Lyte Ampholytes | Reagent | Bio-Rad | Varying pH ranges |
|
| CHAPS | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 13361 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20278 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 15395 | |
| Formic acid | Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28905 | |
| Glycerol | Reagent | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Glycine | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 16407 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Methanol | Reagent | Fisher Scientific | A452 | |
| Mineral oil | Reagent | Bio-Rad | 163-2129 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Tris base | Reagent | Sigma-Aldrich | 93349 | |
| Tris[2-carb–xyethyl] phosphine | Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 77720 | |
| Trypsin Endoproteinase, TPCK treated, MS grade | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 90055 | modified |
| Urea | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 75826 | |
| Water | Reagent | Burdick & Jackson | 365 | |
| Centrivap Concentrator | Tool | Labconco Corp. | ||
| Exquest spot cutter | Tool | Bio-Rad | ||
| LCQ Deca XP Max ion trap mass spectrometer | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Motorized pestle | Tool | Kontes Corp | ||
| Polypropylene stirring | Tool | Biospec Products | ||
| rods | ||||
| PROTEAN IEF cell | Tool | Bio-Rad | ||
| Sonicator | Tool | Branson | ||
| Surveyor Plus HPLC system | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| VersaDoc imaging system | Tool | Bio-Rad |
References
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