Summary
Bu protokol ısı şok sonra hücre içi protein refolding ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, faaliyetlerini etkilemek için moleküler şaperonlar ve bunların eş-faktörleri veya bileşikleri gibi foldases incelemek için kullanılabilir. Firefly lusiferaz aktivitesini muhabir olarak hastabakıcı refolding aktivitesini ölçmek için kullanılır.
Abstract
Bu protokol, bir hücre tabanlı bir sistem ve inhibitör / uyarıcı aktiviteye sahip bileşikler olası etkileri içinde moleküler şaperonlar enzimatik aktivitesini ölçmek için bir yöntem açıklanır. Moleküler şaperonlar 1 katlama protein yönetmelikte yer alan proteinler ve ısı şok 2, besin açlık ve kimyasallar / zehirler 3 maruz kalma gibi stres hakaretler üzerine hücre sağkalım teşvik çok önemli bir rol var. Bu nedenle şaperonlar tümör gelişimi, kanser hücreleri 4 chemioresistance yanı sıra nörodejenerasyon 5 gibi etkinliklere yer bulunur. Bu nedenle, bu enzimlerin aktivitesini inhibe veya teşvik etmek için küçük moleküllerin tasarımı, kanser tedavisi 7 ve nörodejeneratif hastalıkların 9 için en çok çalışılan stratejileri biridir. Burada açıklanan belirli bir moleküler şaperon refolding aktivitesini ölçmek ve comp etkisini araştırmak için tahlil imkanı sunarfaaliyet ounds. Bu yöntemde, incelenen moleküler şaperon gen ateşböceği lusiferaz gen ekspresyon vektörü kodlama ile birlikte transfekte. Zaten denatüre ateşböceği lusiferaz moleküler şaperonlar 10,11 refolded olabileceği tarif edilmiştir. Transfeksiyon kontrolü normalleştirilmesi gibi, renilla lusiferaz gen için bir vektör kodlama transfekte. Bu protokolü açıklanan tüm transfections HEK-293 hücrelerinde X-treme Gen 11 (Roche) ile yapılmaktadır. İlk adımda, protein sentezi, Siklohekzimidsiz hücrelerin tedavi inhibe edilir. Bundan sonra açığa çıkmasını protein 30 dakika boyunca 45 ° C'de ısı şok indüklenir. 37 ° kurtarma üzerine ° C, proteinler yeniden katlanmış ve onların aktif konformasyon ateşböceği lusiferaz faaliyet okuma olarak kullanılır: daha fazla ışık olacak, daha fazla protein orijinal konformasyon yeniden kazanmış olacaktır. Isıl şok hücreleri referans (refolded,% 100 olarak belirlenmiştirlusiferaz).
Protocol
1. Hücreleri Seeding
- Başlamadan önce, 37 az bir su banyosu içinde, kültür ortamı, PBS 1X ve tripsin ısınmak ˚ C
- Kuluçka hücrelerini alın ve orta aspire.
- 5 ml PBS 1X nazikçe yıkayın hücreleri geçerlidir.
- PBS 1X aspire tripsin EDTA% 0,025 içeren 1 ml uygulayın.
- Tripsin eşit bir dağılıma sahip olduğu plaka hafifçe döndürün.
- 37 inkübatör hücrelerin yerleştirin ˚ C (hücre tipine bağlı olarak 5-10 dakika). Zaman zaman kontrol hücreleri plaka sallayarak ayrılmış.
- 10-20 ml orta hücrelerin 50 ml şahin tüp içinde süspanse edin ve onları toplamak.
- Beckman sayacı kullanarak hücre sayımı. Hücrelerin sayısı yaklaşık% 60-70 oranında bir izdiham sağlamak için yeterli olmalıdır.
- Plate hücreleri ve 6-8 saat süreyle tohum onlara izin verir.
2. TransInfeksiyon
- Transfeksiyon için önce 37 ˚ C'ye bir su banyosu içinde bir kısım serum orta ısınmak
- X-treme Gen 9 oda sıcaklığına getirin.
- 2 Eppendorf tüpler serum serbest orta (1 tüp = 1 transfeksiyon) pipetleyin.
- Pipetleyin ucu, 5 dakika, Eppendorf ve inkübe plastik duvar temas edip etmediğini, serum serbest orta ödeyerek dikkat X-treme Gen 9. Bu arada iki DNA karışımlarını hazırlamak: Bir tüp içinde, başka bir tüp renilla, ateş böceği ve moleküler şaperon renilla, ateş böceği ve boş bir vektör kontrolü için plazmid karıştırın.
- + X-treme Gen 9, vortex ve 20 dakika oda sıcaklığında inkübe içeren serum serbest ortam her Eppendorf DNA karışımını ekleyin.
- 37, 24 saat boyunca her plaka ve inkübe üzerine damla damla her karışımı ° C ve% 5 CO 2
3. Yarma hücreleri
- 24 saat sonra transfeksiyon, tryps1.4 'de açıklandığı gibi hücrelere inize - 1.6 ve% 60-70 oranında son bir confluency 6 plaka onları sulandırmak.
- Olmayan şok kontrol için bir tabak hazırlayın ve analiz edilmesi gereken kurtarma zamanı noktaları gibi birçok tabak, Şekil gösterdi. 2.
4. Isı şoku
- Isı çarpması için, önceden ılık serum içeren bir su banyosunda 37 ° orta ˚ C
- 20 mM nihai konsantrasyonu 20 mg / ml ve MOPS serum içeren orta Siklohekzimidsiz içinde seyreltilmesi hazırlayın 'ısı şok tampon.
- Şimdi inkübatör tabak ve orta aspire.
- 'Isı şok tampon' her iyi 1 ml ekleyin ve 37 az 30 dakika boyunca inkübe ˚ C ve% 5 CO 2 (aynı zamanda bu tedavi referans plaka). Bu, de novo protein sentezi durur.
- Bu arada bir su banyosu anahtarı ve temperature ˚ C 45
- Inkübasyondan sonra, daha önce şeritler halinde kesilmiş plakalar Parafilm kapak mühür. Referans plaka (refolfed ateşböceği% 100) inkübatör bırakılır.
- 45 ˚ C 'de 30 dakika boyunca plakalar inkübe edin.
- Su banyosu plakaları çıkarın parafilm kaldırmak ve kurtarma izin inkübatör geri tabak koyun.
- Her zaman noktası hasat hücrelerin az ve 4 için 2000Xg ˚ C'de 1 dakika santrifüj PBS 1X yıkayın
5. Hücre parçalama ve lusiferaz tahlil
- Verimli bir hücre erimesi için, sıvı nitrojen içinde hücre pelletini dondurmak oturtun.
- Bir cam tüp çift distile su 1:05 seyreltilmiş pasif lizis tamponu 200 ul ekleyin.
- 96 plaka 30 ul hücre lizat ekleyin. Her örnek, üç nüsha olarak pipetlenir.
- Sadece olmayan şok 'referans örnek olacakBu adım, eşit transfeksiyon etkinliğini kontrol etmek için kullanılan bu yana, renilla lusiferaz aktivitesini okuyun.
- Test için çözümler hazırlayın. Luciferase çözümü için Gly-Gly tampon son konsantrasyonu 0.2 mM luciferase sulandırmak. Reaksiyon tamponu için Gly-Gly tampon 1mm son konsantrasyonu DTT ve ATP sulandırmak. Coelenterazine reaksiyon tamponu için, nihai konsantrasyonu 0.2 mcM coelenterazine tampon coelenterazine sulandırmak. Luciferase çözüm ve coelenterazine reaksiyon tamponu ışık korumalı tutun.
- Şimdi luminometreye 96-plaka yeri ve programı 'Wallac 1420 İş İstasyonu' başlatmak.
- Coelenterazine çözeltisi içeren şahin tüpe Pump1 tanıtın. Hiç ışık tüpü ile temas böylece kapağını kapatın.
- Seçeneği 'Dispenser bakım menüden seçiniz ve Pump1 işaretleyiniz.
- 'Doldur' seçeneğini seçin.
- Menüde 'plaka düzeni seçeneği düzenlemek için protokol ve sonuç keşfedin. Üzerinde protokol ve çift tıklayarak seçin. Şimdi kuyu okunacak seçin.
- 'Wallac Müdürü' geri dönün ve 'Başlat' düğmesine tıklayın. Renilla lusiferaz ve substrat coelenterazine arasındaki reaksiyon pik, 482 nm dalga boylu ışık yayar.
- Okuduktan sonra, 'Dispenser bakım gidin ve geri kalan tüm çözüm tüp serbest bırakmak için' Boş 've Pump1 seçin.
- Şimdi, su içeren bir şahin tüp tüp taşımak ve 'Flush' işaretleyiniz.
- Kızarma adımdan sonra, 'Boş' seçerek tüp boş.
- Reaksiyon tampon şahin tüp Pump1 ve luciferase şahin tüp Pump2 biri tüp yerleştirin.
- Plaka düzenini değiştirin.
- 'Di Pump1 ve Pump2' Doldur 'seçinSpenser Bakım 'menüsünden.
- Protokolü seçin ve okumaya başlayın. Firefly lusiferaz ve substrat luciferase arasındaki reaksiyon, 560 nm arasında bir zirve dalga boyuna sahip bir ışık yayar.
- Okuma sonunda Pump1 ve Pump2 Flush-Boş Boş işlemi tekrarlayın.
- Sonuçlar 'Wallac 1420 Explorer' artık mevcuttur.
- Her deneyde bir test numarası ile ilişkili, başlangıç ve bitiş tarihi kullanıcı adınızı.
- Sonuçlar artık bir Excel dosyası olarak ihraç edilebilir.
- 1: hesaplamalar için, hücreleri üç gruba ayrılır. olmayan şok referans örnekleri (% 100 ateşböceği lusiferaz refolded set); 2. şok moleküler hastabakıcı ve ısı olmadan hücreler; 3. hücrelerin moleküler şaperon ısı ve şok.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Protein refolding sistem yanlısı çalışıp çalışmadığını test etmek için bu nedenle iyileşme süresi doğrudan ilgili Perly bir tahlil, farklı zaman noktalarında hücrelerin toplanması yapılacak. Doğrudan bir korelasyon zaman / refolding yüzdesi, deney düzgün bir şekilde gerçekleştirilir ve bu nedenle bir sınırlayıcı faktör temsil olduğunu gösterir. Ancak her zaman ısı şokundan sonra refolding doyurarak bir olaydır ve bu nedenle uygun bir zaman ders analizi, herhangi bir deney başlamadan önce yapılmalıdır dikkate alınmalıdır.
Şekil 1. Deney Bakış. In vivo refolding tayininde tamamlanması 3 ila 4 gün gerektirir. Gün 1 hücreleri numaralı seribaşı ve transfekte. Ertesi gün, hücreleri daha küçük bir biçime parçalı ve 3. günde ısı şok. Bu noktada sağ hücreler hasat sonrası lusiferaz tahlil gerçekleştirmek için veya -80 ° C'de hücre pelletini kaydetmek ve bir an tahlil gerçekleştirmek mümkün
Şekil 2. Hücre bölünmesi. Gününde 2 hücreleri 6 plaka ayrılır. Her transfeksiyon aynı plaka üzerindeki tüm transfeksiyon sahip olmak için iyi bir seyreltilmiş olacaktır. Her plaka belirli bir iyileşme süresi artı olmayan bir şok referans plaka karşılık gelir.
Şekil 3. Temsilcisi iyi bir sonuç. Refolding, A. Yüzde doğrudan ateşböceği lusiferaz aktivite ile ölçülür. Her çubuk grafik, farklı kurtarma zaman noktalarında moleküler şaperon varlığı yokluğu (siyah çubuklar) ve (kırmızı bar) refolding yüzdesini temsil eder. B. yokluğu (siyah çizgi) ve hastabakıcı varlığı (kırmızı çizgi) ve refolding arasında korelasyon. R kare değerleri arasında iyi bir korelasyon göstermektedir.
Fig.3A hücrelerin yokluğunda ısı şok (siyah çubuklar) 15, 30, 45, 60 ve 120 dakika sonra ve moleküler şaperon varlığı (kırmızı bar) toplandı bir temsilci sonuçları gösterilir. Yüzde refolded, uzamış iyileşme süresi ve moleküler şaperon transfeksiyon lusiferaz artar. Refolding ve zaman kontrolü (Şekil 3B, siyah çizgi) ve moleküler hastabakıcı-transfekte hücreler (Şekil 3B, kırmızı çizgi) arasındaki ilişki gösterilmiştir.
Şekil 4 Temsilcisi kötü bir sonuç. A. refolding, Yüzde doğrudan luciferase aktivitesi ölçülür. Her çubuk grafik, farklı kurtarma zaman noktalarında moleküler şaperon varlığı yokluğu (siyah çubuklar) ve (kırmızı bar) refolding yüzdesini temsil eder. Yokluğunda ve varlığında zaman ve refolding arasında B. Korelasyon (kırmızı lhastabakıcı ine). R kare değerleri kötü bir korelasyon göstermektedir.
Şekil 4A düzgün yapılan bir deneyin temsili bir sonuç göstermektedir. Kontrol (siyah çubuklar) ve moleküler hastabakıcı-transfekte hücreleri (kırmızı bar) her ikisi de zaman refolding protein bir artış göstermemiştir. Buna ek olarak, moleküler şaperon transfeksiyon refolding bir artışa yol açmamıştır. Bu zayıf bir korelasyon Şekil teyit edilir. Kontrolü (siyah çizgi) ve moleküler hastabakıcı-transfekte hücreler (kırmızı çizgi) için sırasıyla 0,6619 ve 0,1882 r kare değeri gösteren 4B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, moleküler şaperonlar içi refolding aktivitesini ölçmek için bir protokol sunulmuştur. Şekil bakış gösterildiği gibi tüm testi 3 ila 4 gün içinde yapılabilir. 1.
Ateş böceği ve renilla lusiferaz tarafından üretilen ışık sinyali sağlamlık ve doğrusallık, tekrarlanabilirlik protokol için sağlam bir temel temsil eder.
Testin kritik adım, moleküler hastabakıcı ve ateşböceği lusiferaz aşırı ekspresyonu sağlamak için etkin bir transfeksiyon reaktif seçimdir. Muhabir genler, adenovirüs enfeksiyonu 12 veya elektroporasyon gibi diğer yöntemlerle de teslim edilebilir . Bir başka olasılık ise ateşböceği lusiferaz gen stably transfekte, hastabakıcı ifadesi (örneğin tetrasiklin duyarlı organizatörü) 13 kimyasal indüklenebilir bir transgenik hücre hattı kullanımıdır. Optik Bu genişEklentiler birincil hücreler de dahil olmak üzere çok sayıda hücre hatları, testin uygulama böylece mümkün kılar.
Ayrıca bir hücre hattı Siklohekzimidsiz tedaviye özellikle hassas ise, ateşböceği lusiferaz protein çeviri kullanımı repressible / indüklenebilir sistemi tarafından tutuklandı.
Refolding faaliyet moleküler şaperonlar arasında değişebilir transfekte için hastabakıcı miktarı titrasyon her zaman yapılmalıdır. Belirli bir hücre hattı kurulmuş, teknik, küçük moleküller ve / veya gentic manipülasyonlar şaperon faaliyet nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılabilir. Hatta bir 12 plaka tahlil, 6 gibi küçük bir biçimde de yapılabilir.
En dikkat çekici uygulamalar biri şaperon etkinliklerini etkileyen bileşiklerin bütün kütüphaneleri test imkanı. Bu özel durumda, hücre hatları stably muhabir genin yanı sıra kanal ile transfekteaperone tercihen transfeksiyon verimliliği nedeniyle varyasyonlar en aza indirmek için kullanılır.
Bu test aynı zamanda co-aktivatör veya protein refolding ya da ne kadar farklı stres uyaranları (ısı, oksidatif stres, protein yanıt gelişeceğini) üzerine refolding etkisi moleküler şaperonlar co-repressör rolünü araştırmak için kullanılabilir.
Hücre tabanlı bir deney bileşikler ve / veya belirli bir hastabakıcı faaliyet proteinlerin etkisi daha fizyolojik bir okuma sahip olmak mümkün olsa bile, burada sunulan tayini ile hastabakıcı aktivitesini ölçmek için mümkün değildir. Bu durumda, in vitro ateşböceği lusiferaz veya β-galaktosidaz refolding tayininde gibi bir hücre ücretsiz tahlil daha uygun olacaktır .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Danilo Maddalo bir araştırma bursu, Karlsruhe Teknoloji Enstitüsü Genç Araştırmacı Grubu (YIG) olarak bir alıcı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used |
|||
Programs for the Luminometer: |
|||
Renilla: Pump 1, 100 μl injection |
|||
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection |
|||
Luciferin: Pump2, 30μl injection |
|||
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water: |
|||
|
|||
GLY-GLY-buffer: |
|||
|
|||
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter. |
|||
Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer: |
|||
|
|||
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution. |
|||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA |
Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C–lenterazine | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 | |
References
- Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
- Ritossa, F.
- Hendrick, J. P., Hartl, F. U. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins. Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).
- Fuqua, S. A. Heat shock proteins and drug resistance. Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).
- Guzhova, I., Margulis, B. Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology. Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).
- Whitesell, L., Lindquist, S. L.
- Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G.
- Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. Targeting HSP70 for cancer therapy. Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).
- Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats. J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).
- Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).
- Thulasiraman, V., Matts, R. L. Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate. Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).
- Howarth, J. L. Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease. Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).
- Nollen, E. A. Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).
