שב וקיפל תאיים Assay

Summary

בפרוטוקול בשיטה זו כדי למדוד refolding חלבון תאיים לאחר הלם החום מתואר. שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד foldases כמו מלווים המולקולרית שלהם שיתוף גורמים או תרכובות מסוגל להשפיע על פעילותם. פעילות גחלילית בלוציפראז משמש ככתב למדוד refolding פעילות המלווה.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי למדוד את הפעילות האנזימטית של מלווים מולקולרית במערכת התא מבוסס ואת ההשפעות האפשריות של תרכובות בעלות פעילות המעכבת / מגרה. מלווים מולקולרית הם חלבונים המעורבים בוויסות של החלבון המתקפל ¹ יש תפקיד מכריע בקידום ההישרדות תא הלחץ על עלבונות כמו מכת חום ^2, רעב מזין וחשיפה לכימיקלים / רעלים ^3. מסיבה זו מלווים הם מצאו להיות מעורבים באירועים כמו התפתחות הגידול, chemioresistance של ⁴ תאים סרטניים, כמו גם ניוון מוחיים ^5. עיצוב של מולקולות קטנות מסוגל לעכב או להמריץ את הפעילות של אנזימים אלה ולכן הוא אחת האסטרטגיות ביותר למד לטיפול בסרטן ומחלות ניווניות ^{7 9.} Assay המתואר כאן מציע את האפשרות למדוד את פעילות refolding של המלווה מולקולרי מסוים ללמוד את ההשפעה של compounds על פעילותה. בשיטה זו הגן של המלווה המולקולרי הוא נחקר transfected יחד עם קידוד ביטוי עבור וקטור הגן בלוציפראז גחלילית. היא תוארה כבר denaturated בלוציפראז גחלילית ניתן וקיפלתי על ידי מלווים מולקולרית ^10,11. כמו נורמליזציה מלאה transfection, קידוד וקטור עבור הגן בלוציפראז renilla הוא transfected. Transfections כל המתואר בפרוטוקול זה מבוצעות עם X-treme ג'ין ¹¹ (Roche) ב HEK-293 תאים. בשלב הראשון, סינתזת החלבון היא מעוכבת על ידי טיפול בתאי עם cycloheximide. לאחר מכן חלבון התגלגלות הוא המושרה על ידי הלם חום 45 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר התאוששות ב 37 ° C, חלבונים מחדש מקופל לתוך קונפורמציה פעילה שלהם את הפעילות של בלוציפראז גחלילית משמש לקריאה מתוך: האור יותר יופק, החלבון יותר יהיה מחדש זכתה קונפורמציה המקורי. ללא חום תאים בהלם מוגדרות כנקודת התייחסות (100% מכלל וקיפלתיבלוציפראז).

Protocol

1. מתזמן את התאים

1. לפני שמתחילים, לחמם את המדיום תרבות, 1X PBS ואת טריפסין באמבט מים 37 ˚ C
2. קח את התאים מתוך החממה לשאוב את המדיום.
3. בעדינות להחיל 5 מ"ל של PBS 1X על התאים כדי לשטוף אותם.
4. לשאוב 1X PBS וליישם 1 מ"ל של טריפסין המכיל 0,025% EDTA.
5. לסובב בעדינות את הצלחת יש חלוקה שווה של טריפסין.
6. המקום התאים החממה ב 37 ˚ C למשך 5-10 דקות (תלוי בסוג התא). מדי פעם לבדוק אם התאים מנותקים על ידי רועדת את הצלחת.
7. Resuspend התאים 10-20 מ"ל של מדיום ולאסוף אותם צינור בז 50 מ"ל.
8. ספירת התאים באמצעות דלפק Beckman. מספר תאים צריך להיות מספיק כדי להבטיח מפגש של כ 60-70%.
9. פלייט את התאים ולאפשר להם זרע במשך 6-8 שעות.

2. טרנסfection

1. לפני transfection, להתחמם aliquot של המדיום בסרום ללא באמבט מים ב 37 ˚ C.
2. תביאו את X-treme ג'ין 9 לטמפרטורת החדר.
3. Pipet המדיום החופשי בסרום 2 צינורות Eppendorf (1 שפופרת = 1 transfection).
4. Pipet X-treme ג'ין 9 תשומת לב בינוני בסרום החופשי משלמים כי טיפ אינו נוגע בקיר הפלסטיק של Eppendorf ו דגירה במשך 5 דקות. בינתיים להכין שתי תערובות DNA: בתוך הגליל האחד לערבב יחד את פלסמידים עבור renilla, גחלילית ואת פקד וקטור ריק, ב renilla עוד צינור, גחלילית ואת המלווה מולקולרית.
5. מוסיפים את תערובת DNA זה Eppendorf המכיל מדיום חופשי בדם + X-treme ג'ין 9, מערבולת דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
6. הוסף dropwise כל תערובת לצלחת כל דגירה למשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO ₂

3. פיצול תאים

1. 24 שעות אחרי, tryps transfectioninize התאים כמתואר 1.4-1.6 ו לדלל אותם confluency סופי של 60-70% על צלחת 6 באר.
2. הכינו צלחת אחת על השליטה הלא בהלם וכפי הצלחות רבות ככל הפעם נקודות שחזור כי צריך להיות מנותח, כמו הראו באיור. 2.

4. מחממים הלם

1. עבור הלם חום, טרום חם סרום המכיל בינוני באמבט מים ב 37 ˚ C.
2. הכן "הלם החום חיץ" על ידי דילול ב cycloheximide בסרום בינוני המכיל ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - מגבים ל 20 מ"מ.
3. כעת מוציאים את הצלחות מן החממה לשאוב את המדיום.
4. הוסף 1 מ"ל כל טוב של "חיץ הלם חום", ו דגירה במשך 30 דקות ב 37 ˚ C ו 5% של CO ₂ (כוללים גם את הצלחת הפניה לטיפול זה). זה יעצור דה נובו סינתזת החלבון.
5. ב לעבור בינתיים על אמבט מים ולהגדיר את temperature ב 45 ˚ C.
6. לאחר דגירה, לאטום את המכסה של צלחות עם Parafilm בעבר לחתוך פסים. צלחת ההתייחסות (100% מכלל refolfed גחלילית) נשאר בחממה.
7. דגירה צלחות ב 45 ˚ C במשך 30 דקות.
8. הסר את הצלחות מן האמבטיה במים, להסיר את parafilm ולשים את הצלחות בחזרה בחממה כדי לאפשר התאוששות.
9. בשלב הקציר בכל פעם לנקודה תאים לשטוף אותם PBS 1X ידי centrifuging ב 2000Xg דקה 1 בשעה 4 ˚ C.

5. תא תמוגה ו assay בלוציפראז

1. עבור תמוגה תא יעיל, הצמד להקפיא את התא גלולה בחנקן נוזלי.
2. הוסף 200 μl של חיץ תמוגה פסיבי בדילול 1:05 במים מזוקקים כפול בתוך שפופרת זכוכית.
3. הוסף 30 μl של lysate התא בצלחת 96 באר. מדגם כל pipetted בשלושה עותקים.
4. רק "לא מזועזע" דגימות התייחסות ישמשלקרוא את פעילות בלוציפראז renilla, שכן צעד זה נעשה שימוש כדי לבדוק יעילות transfection שווים.
5. הכן את פתרונות assay. עבור הפתרון luciferin לדלל luciferin לריכוז סופי של mM 0.2 במאגר גלאי, גלאי. עבור למאגר התגובה לדלל DTT ו-ATP ריכוז 1mm הסופי חיץ גלאי, גלאי. בשביל חיץ התגובה coelenterazine, לדלל coelenterazine לריכוז סופי של 0.2 מיקרומטר במאגר coelenterazine. שמור על פתרון luciferin והתגובה coelenterazine חיץ אור מוגן.
6. עכשיו במקום צלחת 96-היטב luminometer ועל להפעיל את תוכנית 'Wallac 1420 תחנת עבודה ".
7. להציג את Pump1 לתוך הצינור בז המכיל את פתרון coelenterazine. סגור את המכסה כך אור לא יכול לבוא במגע עם הצינור.
8. בחר מתוך התפריט "תחזוקה Dispenser" וסמן את האפשרות Pump1.
9. בחר באפשרות "מלא".
10. כדי לערוך את פריסת צלחת לבחור באפשרות "חקור פרוטוקול ותוצאות" בתפריט. בחר את פרוטוקול לחץ פעמיים על זה. כעת בחר את בארות לקרוא.
11. חזור אל "Wallac מנהל" ולחץ על "התחל". התגובה בין בלוציפראז renilla ו coelenterazine המצע שלה פולט אור עם אורך גל של 482 ננומטר השיא.
12. לאחר קריאת, ללכת על "תחזוקה Dispenser 'ובחר' ריק 'ו Pump1 לשחרר את כל הפתרון שיורית חזרה הצינור.
13. עכשיו להעביר את צינור לצינור בז המכיל מים לתקתק "פלאש".
14. לאחר שלב השטיפה לרוקן את הצינור על ידי בחירת 'ריקה'.
15. מניחים את הצינור מתוך Pump1 בתוך הצינור חיץ התגובה הבז ואת אחד מן Pump2 בצינור luciferin בז.
16. שינוי הפריסה צלחת.
17. בחר "מלא" עבור Pump1 ו Pump2 מ 'דיספנסר תחזוקה "בתפריט.
18. בחר את הפרוטוקול ואת תחילת הקריאה. התגובה בין בלוציפראז Firefly ו luciferin המצע שלה פולט אור עם אורך גל של 560 ננומטר השיא.
19. בסוף הקריאה לחזור על התהליך בידיים ריקות, ריקון עבור Pump1 ו Pump2.
20. תוצאות זמינים כעת ב 'Wallac 1420 Explorer ".
21. כל הניסוי קשורה למספר assay, שם משתמש, להתחיל ולסיים תאריך.
22. תוצאות כעת ניתן לייצא כקובץ Excel.
23. עבור חישובים, התאים מתחלקים לשלוש קבוצות: 1. לא בהלם התייחסות דגימות (כמפורט 100% וקיפלתי גחלילית בלוציפראז); 2. תאים ללא המלווה בחום מולקולרית בהלם; 3. תאים עם המלווה בחום מולקולרית בהלם.

6. נציג תוצאות

Refolding חלבון קשורה ישירות הזמן של ההתאוששות ולכן כדי לבדוק אם המערכת עובדת הפרו perly, assay צריך להתבצע איסוף התאים בנקודות זמן שונות. קשר ישיר זמן / אחוז refolding מציין כי הניסוי שבוצעה כהלכה, ולכן מהווה גורם מגביל. עם זאת, יש להתייחס תמיד refolding לאחר הלם החום הוא אירוע להרוות ולכן ניתוח תקין כמובן זמן יש לבצע לפני תחילת כל ניסוי.

באיור 1. סקירה של הניסוי. ב assay refolding vivo דורש 3 עד 4 ימים להסתיים. ביום 1 תאים seeded ו transfected. תאים למחרת הם splitted לפורמט קטן יותר ביום 3 הם חום בהלם. בשלב זה ניתן לבצע את assay בלוציפראז מיד לאחר קצירת התאים או לשמור את תא גלולה ב -80 ° C ו לבצע את assay עוד רגע

_content ">
באיור 2. חלוקת התא. ביום 2 תאים מחולקים צלחת 6 באר. כל transfection יהיה מדולל היטב על מנת לקבל את כל transfection בצלחת אחת. כל צלחת יתאים זמן החלמה מסוים בתוספת צלחת ללא התייחסות בהלם.

באיור 3. תוצאה טובה נציג. שיעור א 'של refolding נמדד ישירות על ידי פעילות גחלילית בלוציפראז. כל תרשים בר מייצג את אחוז refolding בהעדר (פסים שחורים) ובנוכחות (מוטות אדום) של המלווה מולקולרי בנקודות זמן שונות התאוששות. ב קורלציה בין זמן refolding בהעדר (קו שחור) ובנוכחות (הקו האדום) של המלווה. ערכי r בריבוע עולה מתאם טוב.

ב Fig.3A מוצג תוצאות נציג שבו תאים שנאספו דקות 15, 30, 45, 60 ו - 120 לאחר הלם החום בהעדר (פסים שחורים) ובנוכחות (מוטות אדום) של המלווה מולקולרית. אחוז וקיפלתי מגביר בלוציפראז עם זמן החלמה ממושך עם transfection של המלווה המולקולרית. המתאם בין refolding זמן לשליטה (איור 3B, קו שחור) לבין המלווה המולקולרי-transfected התאים (איור 3B, קו אדום) מוצגת.

איור 4. תוצאה רעה נציג. שיעור א 'של refolding נמדד ישירות על ידי פעילות בלוציפראז. כל תרשים בר מייצג את אחוז refolding בהעדר (פסים שחורים) ובנוכחות (מוטות אדום) של המלווה מולקולרי בנקודות זמן שונות התאוששות. ב קורלציה בין זמן refolding בהעדר ובנוכחות (אדום line) של המלווה. הערכים מצביעים על מתאם r בריבוע רע.

איור 4 א. מראה תוצאה נציג של ניסוי לא ביצע כראוי. גם הביקורת (פסים שחורים) לבין המלווה המולקולרי-transfected תאים (ברים אדומה) לא הראה עלייה חלבון refolding עם הזמן. בנוסף, transfection של המלווה המולקולרי לא הביא לעלייה של refolding. מתאם זה עני הוא אישר באיור. 4B מראה ערך r בריבוע של 0.6619 ו 0.1882 בהתאמה לשליטה (קו שחור) המולקולרית המלווה-transfected תאים (קו אדום).

Discussion

בעבודה זו בפרוטוקול כדי למדוד את פעילות refolding תאיים של מלווים מולקולרית מוצג. Assay כולו ניתן לבצע 3 עד 4 ימים כפי שמוצג על ידי סקירה של איור. 1.

עמידות ליניאריות של אות אור המיוצר על ידי גחלילית ואת בלוציפראז renilla מהווים בסיס מוצק עבור שחזור של הפרוטוקול.

השלב הקריטי של assay היא הבחירה של מגיב transfection יעיל על מנת להבטיח את overexpression של המלווה המולקולרי ואת בלוציפראז גחלילית. גנים Reporter יכולה להיות מועברת גם עם שיטות אחרות כמו ¹² או זיהום electroporation adenoviral. אפשרות נוספת היא להשתמש בשורה תא מהונדס שם את הביטוי של המלווה הוא כימי ועין מתנהלת (למשל מקדם טטרציקלין מגיב) ^13, ואילו גן של גחלילית בלוציפראז הוא transfected ביציבות. זה מגוון רחב של optiלפיירפוקס מאפשר אפוא את הבקשה של assay על שורות תאים, כולל תאים ראשוניים.

יתרה מזאת, אם קו התא הוא רגיש במיוחד לטיפול cycloheximide, תרגום גחלילית בלוציפראז חלבון עלול להיעצר על ידי שימוש repressible / מערכת ועין מתנהלת.

מאז פעילות refolding יכול להשתנות בין מלווים מולקולרית, טיטרציה של כמות המלווה להיות transfected צריך להיעשות תמיד. הוקמה לאחר בקו תא מסוים, הטכניקה יכולה לשמש כדי לחקור כיצד מולקולות קטנות ו / או מניפולציות gentic יכול להשפיע על פעילות המלווה. Assay יכול להתבצע גם בפורמט קטן יותר, כמו 6 - או אפילו צלחת 12-היטב.

אחד היישומים הכי אטרקטיבי היא האפשרות לבחון ספריות שלמות של תרכובות שיכולות להשפיע על פעילות המלווה. במקרה ספציפי זה, שורות תאים transfected ביציבות עם הגן הכתב, כמו גם את פרקaperone משמשים מעדיפים, כדי למזער וריאציות בשל יעילות transfection.

Assay זה יכול לשמש גם כדי לחקור את התפקיד של שיתוף activators או שיתוף repressor של מלווים מולקולרית refolding חלבון או כיצד הם משפיעים על גירויים refolding מתח שונים (חום, סטרס חמצוני, פרש בתגובה חלבון).

גם אם מניסוי תא מבוססי ניתן להם readout פיזיולוגיים יותר של ההשפעה של תרכובות ו / או חלבונים על פעילות המלווה מסוים, לא ניתן לכמת את הפעילות המלווה עם assay המוצג כאן. במקרה זה יהיה מתאים יותר assay תא חופשי כמו assay במבחנה refolding של בלוציפראז גחלילית או β-galactosidase.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used
Programs for the Luminometer:
Renilla: Pump 1, 100 μl injection
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection
Luciferin: Pump2, 30μl injection
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:
- 1M MgSO4 : 246,48g MgSO4*7H2O in 1 liter - 0,5M EGTA: 190,18g EGTA in 1 liter - 1M KH2PO4: 136,09g KH2PO4 in 1 liter - 1M K2HPO4: 228,23g K2HPO4*3H2O in 1 liter - 5M NaCl: 292,2g NaCl in 1 liter - 0,5M EDTA: 186,12g EDTA*2H2O in 1 liter
GLY-GLY-buffer:
- 25mM Glycylglycin - 15mM MgSO4 - 4mM EGTA
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.
Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer:
- 13,4mM KH2PO4 - 86,6mM KH2PO4 - 0,5M NaCl - 1mM EDTA
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X)	GIBCO	41966029
Fetal Bovine Serum Gold	PAA	A15-151
X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent	Roche	06365809001
PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X	GIBCO	14190-094
MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid	SIGMA-ALDRICH	M1254
Cycloheximide	SIGMA-ALDRICH	C7698
Passive Lysis Buffer 5X	Promega	E194A
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O)	SIGMA-ALDRICH Roth Roth	G7278 3054.2 P027.1
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA	Roth Roth Roth Roth	3904.1 6878.2 3957.1 8043.1
Luciferin Firefly	Biosynth	L8200
C–lenterazine	Biosynth	C7000
DTT (Dithiothreitol)	Roth	6908.2
ATP (Adenosine Triphosphate)	Roche	10519987001