Summary
Neste protocolo um método para medir refolding proteína intracelular após choque térmico é descrito. Este método pode ser usado para estudar foldases como chaperonas moleculares e seus co-fatores ou compostos capazes de influenciar a sua actividade. Firefly luciferase atividade é utilizado como repórter para medir a atividade refolding acompanhante.
Abstract
Este protocolo descreve um método para medir a atividade enzimática de chaperones moleculares em um sistema baseado em células e os possíveis efeitos de compostos com atividade inibitória / estimulante. Chaperones moleculares são proteínas envolvidas na regulação do enovelamento de proteínas 1 e têm um papel crucial na promoção da sobrevivência celular após insultos estresse, como choque térmico 2, a fome de nutrientes e exposição a produtos químicos / venenos 3. Por esta razão chaperones são encontrados para ser envolvido em eventos como o desenvolvimento do tumor, chemioresistance das células cancerosas 4, bem como neurodegeneração 5. Desenho de pequenas moléculas capazes de inibir ou estimular a atividade destas enzimas é, portanto, uma das estratégias mais estudadas para terapia de câncer e doenças neurodegenerativas 7 9. O ensaio aqui descrito oferece a possibilidade de medir a atividade refolding de um chaperone molecular particular e para estudar o efeito da compounds sobre a sua actividade. Neste método o gene da chaperone molecular investigado é transfectadas com uma codificação de vetor de expressão para o gene luciferase vaga-lumes. Já foi descrito que a luciferase firefly desnaturado podem ser reabertos por chaperones moleculares 10,11. Como normalizar o controle de transfecção, uma codificação de vetor para o gene luciferase é renilla transfectadas. Todos os transfections descritos neste protocolo são realizadas com X-treme Gene 11 (Roche) em células HEK-293. Na primeira etapa, a síntese protéica é inibida pelo tratamento das células com cicloheximida. Posteriormente proteína desdobramento é induzida por choque térmico a 45 ° C por 30 minutos. Após a recuperação, a 37 ° C, as proteínas são re-dobrada em sua conformação ativa e da atividade da luciferase firefly é usado como ler-out: quanto mais luz será produzido, o mais proteína terá re-ganhou a conformação original. Não-calor células chocado são definidos como referência (100% de refoldedluciferase).
Protocol
1. Semeadura das células
- Antes de começar, aqueça o meio de cultura, a PBS 1X e da tripsina em banho-maria a 37 ˚ C
- Tome as células fora da incubadora e aspirar o médio.
- Aplicar suavemente 5 mL de PBS 1X sobre as células de lavá-las.
- Aspirar o PBS 1X e aplicar 1 mL de tripsina contendo 0,025% EDTA.
- Gire gentilmente a placa para ter uma distribuição uniforme da tripsina.
- Coloque as células na incubadora a 37 ˚ C por 5-10 minutos (dependendo do tipo de célula). De tempos para verificar o tempo se as células são separadas por agitação da placa.
- Ressuspender as células em 10-20 mL de meio e recolhê-las em um tubo falcon 50 mL.
- Contar as células utilizando um contador Beckman. O número de células deve ser suficiente para garantir uma confluência de aproximadamente 60-70%.
- Placa das células e permitir-lhes sementes de 6-8 horas.
2. Transfection
- Antes de transfecção, aquecer uma alíquota de soro livre médio em banho-maria a 37 ˚ C.
- Trazer o Gene X-treme 9 a temperatura ambiente.
- Pipeta o meio isento de soro em dois tubos de eppendorf (1 tubo de transfecção = 1).
- Pipeta o Gene X-treme 9 na atenção meio isento de soro pagar que a ponta não toca a parede de plástico do eppendorf e incubar por 5 minutos. Nesse meio tempo preparar duas mixagens DNA: em um tubo de misturar os plasmídeos para renilla, vagalume e um controle do vetor vazio, em outro renilla tubo, firefly ea acompanhante molecular.
- Adicione a mistura de DNA de cada eppendorf contendo meio livre de soro + X-treme Gene 9, vortex e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos.
- Adicionar gota a gota cada mistura em cada placa e incubar por 24 horas a 37 ° C e CO 2 5%
3. Divisão das células
- 24 horas após a transfecção, trypsinize as células como descrito em 1,4-1,6 e diluí-los a uma confluência final de 60-70% em uma placa de 6 poços.
- Prepare um prato para o controle não-chocado e como muitos pratos como os pontos de tempo de recuperação que têm de ser analisados, como mostrado na figura. 2.
4. Choque térmico
- Para choque de calor, pré-aquecido soro contendo meio em banho-maria a 37 ˚ C.
- 'Buffer de choque térmico "preparar diluindo em meio cicloheximida soro contendo uma concentração final de 20 mcg / ml e MOPS a 20 mM.
- Agora tire as placas da incubadora e aspire o meio.
- Adicionar a cada 1 mL de bem 'buffer de choque de calor ", e incubar por 30 minutos a 37 ˚ C e 5% de CO 2 (incluem também a placa de referência neste tratamento). Isto irá parar de novo a síntese de proteínas.
- Enquanto isso no interruptor em um banho de água e definir o temperatura de 45 ˚ C.
- Após a incubação, a tampa de vedação das placas com Parafilm previamente cortados em tiras. A placa de referência (100% de refolfed vagalume) fica na incubadora.
- Incubar as placas a 45 ˚ C durante 30 minutos.
- Remova as placas do banho-maria, retire o parafilme e colocar as placas de volta para a incubadora para permitir a recuperação.
- Em cada ponto de colheita o tempo as células e lavá-los em PBS 1X por centrifugação em 2000Xg por 1 minuto a 4 ˚ C.
5. Lise celular e ensaio de luciferase
- Para uma lise celular eficiente, snap congelar o pellet celular em nitrogênio líquido.
- Adicionar 200 mL de tampão de lise passiva diluído 1:5 em água destilada duas vezes em um tubo de vidro.
- Adicionar 30 mL do lisado de células em uma placa de 96 também. Cada amostra é pipetados em triplicata.
- Apenas o "não chocado" amostras de referência será utilizado paraler a atividade renilla luciferase, uma vez que esta etapa é utilizado para verificar a eficiência de transfecção iguais.
- Preparar as soluções para o ensaio. Para a solução de luciferina luciferina diluir para uma concentração final de 0,2 mM em Gly-Gly buffer. Para o tampão de reação diluir TDT e ATP a concentração final 1mM em Gly-Gly buffer. Para tampão de reação celenterazina, diluir celenterazina para uma concentração final de 0,2 mM em tampão celenterazina. Mantenha solução luciferina e celenterazina luz tampão de reação protegida.
- Agora coloque a placa de 96 poços na luminómetro e iniciar o programa 'Wallac 1420 Workstation.
- Introduzir o Pump1 no tubo falcon contendo a solução celenterazina. Feche a tampa para que a luz não pode entrar em contato com o tubo.
- Escolha no menu 'manutenção Dispenser' a opção e marque Pump1.
- Selecione a opção "Fill".
- Para editar o layout da placa escolha a opção "Explorar protocolo e resultados" no menu. Selecione o protocolo e clique duas vezes sobre ele. Agora selecione os poços a serem lidos.
- Voltar ao 'Wallac Manager' e clique em "Iniciar". A reação entre o luciferase renilla e seu substrato celenterazina emite luz com um comprimento de onda de 482 nm.
- Após a leitura, vá em "manutenção Dispenser 'e selecione' Vazio 'e Pump1 para liberar toda a solução residual de volta para o tubo.
- Agora mova o tubo para um tubo falcon contendo água e marque a opção 'flush'.
- Após a etapa de lavagem, esvaziar o tubo por selecionar 'vazio'.
- Colocar o tubo de Pump1 no tubo do tampão de reação falcon e um da Pump2 no tubo falcon luciferina.
- Alterar o layout da placa.
- Selecione 'Preencher' para Pump1 e Pump2 da Di 'menu de Spenser Manutenção '.
- Selecione o protocolo e iniciar a leitura. A reação entre o Firefly luciferase e luciferina seu substrato emite luz com um comprimento de onda de 560 nm.
- No final da leitura repita o procedimento Vazio-Flush-vazio para Pump1 e Pump2.
- Resultados já estão disponíveis no 'Wallac 1420 Explorer'.
- Cada experimento é associado a um número ensaio, nome de usuário, data de início e fim.
- Resultados podem ser exportados como um arquivo de Excel.
- Para os cálculos, as células são divididas em três grupos: 1. não chocou amostras de referência (definido como 100% de refolded firefly luciferase), 2. células sem chaperone molecular e calor chocado; 3. células com chaperone molecular e calor chocado.
6. Resultados representante
Refolding proteína está diretamente relacionada ao tempo de recuperação, portanto, para testar se o sistema está funcionando pro Perly, um ensaio deve ser realizada coleta de células em diferentes momentos. A correlação direta tempo / percentual de refolding indica que o experimento foi devidamente realizado e, portanto, representa um fator limitante. No entanto, deve ser sempre considerado que refolding após choque térmico é um evento saturando e, portanto, uma análise adequada do tempo é claro deve ser realizada antes de iniciar qualquer experimento.
Figura 1. Visão geral do experimento. Ensaio in vivo de refolding exige 3 a 4 dias para ser concluída. No dia 1 células são semeadas e transfectadas. As células são parceladas dia seguinte em um formato menor e no dia 3 de calor são chocados. Neste ponto é possível realizar o ensaio de luciferase logo após a colheita as células ou para salvar o pellet celular a -80 ° C e realizar o teste em outro momento
Figura 2. Divisão celular. No dia 2 células dividem-se em uma placa de seis poços. Cada transfecção será diluído em um poço, a fim de ter todos os transfecção no mesmo prato. Cada placa irá corresponder a um tempo de recuperação especial além de uma placa de referência não chocado.
Figura 3. Bom resultado Representante. A. Porcentagem de refolding medido diretamente pela atividade firefly luciferase. Cada gráfico de barras representa a porcentagem de refolding na ausência (barras pretas) e na presença (barras vermelhas) de uma chaperone molecular em diferentes momentos de recuperação. B. Correlação entre tempo e redobrando na ausência (linha preta) e na presença (linha vermelha) de acompanhante. Os valores de r ao quadrado indicam boa correlação.
Em Fig.3A é mostrado um resultado representativo onde as células foram coletadas 15, 30, 45, 60 e 120 após choque térmico na ausência (barras pretas) e na presença (barras vermelhas) de chaperone molecular. Percentual de refolded aumenta luciferase com o tempo de recuperação prolongado e com a transfecção do chaperone molecular. A correlação entre refolding e tempo para o controle (Fig. 3B, linha preta) e do chaperone molecular células transfectadas (Fig. 3B, linha vermelha) é mostrado.
Figura 4. Representante mau resultado. A. Porcentagem de refolding medido diretamente pela atividade luciferase. Cada gráfico de barras representa a porcentagem de refolding na ausência (barras pretas) e na presença (barras vermelhas) de uma chaperone molecular em diferentes momentos de recuperação. B. Correlação entre tempo e redobrando na ausência e na presença (vermelho line) de acompanhante. Os valores de r ao quadrado indicam correlação ruim.
Figura 4A. Mostra um resultado representativo de uma experiência não adequadamente realizada. Tanto o controle (barras pretas) eo chaperone molecular transfectadas células (barras vermelhas) não mostraram um aumento na proteína refolding com o tempo. Além disso, transfecção do chaperone molecular não resultou em um aumento de renaturação. Esta baixa correlação é confirmada na fig. 4B mostrando um valor de r quadrados de 0,6619 e 0,1882, respectivamente, para o controle (linha preta) e do chaperone molecular transfectadas células (linha vermelha).
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Discussion
Neste trabalho um protocolo para medir a atividade refolding intracelular de chaperones moleculares é apresentado. O ensaio completo pode ser realizado em 3 a 4 dias como mostra a visão geral na fig. 1.
A robustez ea linearidade do sinal de luz produzida pelo vaga-lume ea luciferase renilla representam uma base sólida para a reprodutibilidade do protocolo.
A etapa crítica do ensaio é a escolha de um reagente de transfecção eficiente para garantir a superexpressão do chaperone molecular ea luciferase vaga-lumes. Genes repórter pôde ser entregue também com outros métodos, como a infecção adenoviral 12 ou eletroporação. Outra possibilidade é o uso de uma linhagem de células transgênicas em que a expressão do acompanhante é quimicamente induzida (por exemplo, um promotor de tetraciclina-responsiva) 13, enquanto o gene da luciferase firefly é estavelmente transfectadas. Esta ampla gama de opções deons torna assim possível a aplicação do ensaio de diversas linhagens, incluindo células primárias.
Além disso, se uma linha celular é particularmente sensível ao tratamento cicloheximida, firefly luciferase tradução da proteína poderia ser preso pelo uso um repressor / sistema induzível.
Desde que a atividade refolding pode variar entre os chaperones moleculares, uma titulação da quantidade de acompanhante a ser transfectadas deve ser sempre feito. Uma vez estabelecida em uma linha celular particular, a técnica pode ser usada para investigar como pequenas moléculas e / ou manipulações gentic pode afetar a atividade chaperone. O ensaio pode ser realizado também em um formato menor, como um 6 - ou mesmo uma placa de 12 poços.
Uma das aplicações mais atraentes é a possibilidade de testar bibliotecas inteiras de compostos que podem influenciar a atividade chaperone. Neste caso particular, linhagens de células estavelmente transfectadas com o gene repórter, bem como a chaperone são preferencialmente utilizados, a fim de minimizar variações devido à eficiência de transfecção.
Este ensaio também pode ser usado para investigar o papel de co-ativadores ou co-repressor da chaperones moleculares em refolding proteína ou como elas influenciam redobrando sobre estímulos diferentes do stress (calor, estresse oxidativo, desdobrado resposta proteína).
Mesmo se a partir de uma experiência baseada em células é possível ter uma leitura mais fisiológico do efeito de compostos e / ou proteínas sobre a atividade de um acompanhante particular, não é possível quantificar a atividade chaperone com o ensaio aqui apresentado. Neste caso seria mais adequado um ensaio livre de células in vitro como ensaio de renaturação de firefly luciferase ou β-galactosidase.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Danilo Maddalo é beneficiário de uma bolsa de pesquisa no Grupo de Jovem Pesquisador (YIG) do Instituto de Tecnologia de Karlsruhe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used |
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Programs for the Luminometer: |
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Renilla: Pump 1, 100 μl injection |
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Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection |
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Luciferin: Pump2, 30μl injection |
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For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water: |
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GLY-GLY-buffer: |
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For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter. |
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Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer: |
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For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution. |
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| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA |
Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C–lenterazine | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 | |
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