Summary
I detta protokoll en metod för att mäta intracellulära proteinet vika efter heat shock beskrivs. Denna metod kan användas för att studera foldases som molekylära följeslagare och deras co-faktorer eller föreningar möjlighet att påverka deras verksamhet. Firefly luciferas aktivitet används som reporter för att mäta aktiviteten förkläde vika.
Abstract
Detta protokoll beskriver en metod för att mäta den enzymatiska aktiviteten hos molekylära följeslagare i en cell-baserat system och eventuella effekter av substanser med hämmande / stimulerande aktivitet. Molekylär följeslagare är proteiner involverade i regleringen av protein folding 1 och har en avgörande roll för att främja cellöverlevnad på stressen förolämpningar som heat shock 2, näringsämnen svält och exponering för kemikalier / gifter 3. Av denna anledning följeslagare befinns vara inblandade i händelser som tumörutveckling, chemioresistance av cancerceller 4 samt neurodegeneration 5. Design av små molekyler kan hämma eller stimulera aktiviteten hos dessa enzymer är därför en av de mest studerade strategierna för cancerbehandling 7 och neurodegenerativa sjukdomar 9. Analysen beskrivs här ger möjlighet att mäta vika aktiviteten av en viss molekylär förkläde och att studera effekten av Compounds om sin verksamhet. I denna metod genen av de undersökta molekylära förkläde är transfekterade tillsammans med ett uttryck vektor kodning för eldfluga luciferas genen. Det har redan beskrivits som denaturerad eldfluga luciferas kan refolded av molekylära följeslagare 10,11. Som normalisera transfektion kontroll, är en vektor kodning för renilla luciferas genen transfekterades. Alla transfections som beskrivs i detta protokoll utförs med X-treme Gene 11 (Roche) i HEK-293 celler. I det första steget är proteinsyntesen hämmas genom att behandla cellerna med cykloheximid. Därefter proteinet utspelas induceras av värme chock vid 45 ° C i 30 minuter. När återhämtningen vid 37 ° C, är proteiner åter viks i deras aktiva konformation och aktivitet för Firefly luciferas används som läste ut: desto mer ljus kommer att produceras, desto mer protein har åter fått den ursprungliga exteriör. Icke-värme chockad cellerna in som referens (100% av refoldedluciferas).
Protocol
1. Sådd cellerna
- Före start, värma upp odlingsmedium PBS 1X och trypsin i ett vattenbad vid 37 ˚ C
- Ta cellerna ur kuvösen och aspirera mediet.
- Applicera försiktigt 5 mL PBS 1X på cellerna för att tvätta dem.
- Aspirera PBS 1X och applicera 1 ml trypsin innehåller 0,025% EDTA.
- Snurra plattan att ha en jämn fördelning av trypsin.
- Placera cellerna i inkubator vid 37 ˚ C i 5-10 minuter (beroende på celltyp). Från tid till annan kolla om cellerna loss genom att skaka plattan.
- Resuspendera cellerna i 10-20 ml medium och samla dem i en 50 ml Falcon rör.
- Räkna celler med användning av Beckman disk. Antalet celler bör vara tillräckligt för att garantera en sammanflödet av cirka 60-70%.
- Plate cellerna och tillåta dem att utsäde för 6-8 timmar.
2. Transfection
- Före transfektion, värma upp en alikvot av serumfritt medium i ett vattenbad vid 37 ˚ C.
- Ta med X-treme Gene 9 till rumstemperatur.
- Pipettera serum fritt medium i 2 Eppendorf-rör (1 tub = 1 transfektion).
- Pipettera X-treme Gene 9 i serum fria medel att uppmärksamma att spetsen inte vidrör plast vägg Eppendorf och inkubera i 5 minuter. Under tiden förbereder två DNA-mixar: i ett rör Blanda plasmider för renilla, eldfluga och en tom vektorstyrning, i ett annat rör renilla, Firefly och molekylära förkläde.
- Lägg till DNA-mixen till varje Eppendorf innehåller serum utan Medium + X-treme Gene 9, virvel och inkubera vid rumstemperatur i 20 minuter.
- Tillsätt droppvis varje blandningen på varje tallrik och inkubera i 24 timmar vid 37 ° C och 5% CO 2
3. Dela upp celler
- 24 timmar efter transfektion, trypsinize cellerna som beskrivs i 1,4 till 1,6 och späda ut dem till en slutlig confluency på 60-70% i en 6-brunnar.
- Förbered en tallrik för icke-chockade-kontroll och lika många tallrikar som de punkter återhämtningstid som måste analyseras, såsom framgår av figur. 2.
4. Heat shock
- För värme chock, förvärma serum som innehåller medium i ett vattenbad vid 37 ˚ C.
- Förbered "heat shock buffer" genom att späda i serum innehållande medelstora cykloheximid till en slutlig koncentration på 20 mikrogram / ml och moppar till 20 mm.
- Nu tar ut plåtarna ur kuvösen och aspirera mediet.
- Lägg till i varje brunn 1 mL av "Heat shock buffer", och inkubera i 30 minuter vid 37 ˚ C och 5% av CO 2 (inkluderar också hänvisningen plattan i denna behandling). Detta kommer att stoppa de novo proteinsyntes.
- Under tiden slår på ett vattenbad och ställ temperature vid 45 ˚ C.
- Efter inkubation, försegla locket på plåtar med Parafilm skurna i ränder. Hänvisningen plattan (100% av refolfed firefly) är kvar i inkubatorn.
- Inkubera plattorna vid 45 ˚ C i 30 minuter.
- Ta ut plåtarna ur vattenbadet, ta bort parafilm och lägga plattorna tillbaka till inkubatorn för att tillåta återhämtning.
- Vid varje tidpunkt skörd cellerna och tvätta dem i PBS 1X genom att centrifugera vid 2000Xg i 1 minut vid 4 ˚ C.
5. Cellslys och luciferas analys
- För en effektiv cellslys, knäppa frysa cellpelleten i flytande kväve.
- Tillsätt 200 l av passiva lyseringsbuffert späds 1:05 i dubbeldestillerat vatten i ett glasrör.
- Tillsätt 30 l av cellen lysat i 96 brunnar. Varje prov pipetteras i tre exemplar.
- Endast de "icke chockad" referensprov ska användas för attläs renilla luciferas verksamhet, eftersom detta steg används för att kontrollera lika transfektion effektivitet.
- Förbered lösningarna för analysen. För luciferin lösningen späda luciferin till en slutlig koncentration av 0,2 mm i Gly-Gly buffert. För den reaktionen buffert späda DTT och ATP till 1mm slutlig koncentration i Gly-Gly buffert. För coelenterazine reaktion buffert, späd coelenterazine till en slutlig koncentration av 0,2 nm i coelenterazine buffert. Håll luciferin lösning och coelenterazine reaktion buffert ljus skyddade.
- Placera nu 96-brunnar i luminometer och starta programmet "Wallac 1420 Workstation".
- Introducera Pump1 i falken röret med coelenterazine lösningen. Stäng locket så att inget ljus kan komma i kontakt med röret.
- Välj från menyn alternativet "Dispenser underhåll" och bocka Pump1.
- Välj alternativet "fyll".
- Om du vill redigera plattan layout väljer alternativet "Utforska protokoll och resultat" på menyn. Välj protokollet och dubbelklicka på den. Nu väljer de brunnar som ska läsas.
- Gå tillbaka till "Wallac Manager" och klicka på "Start". Reaktionen mellan renilla luciferas och dess substrat coelenterazine sänder ut ljus med en topp våglängd på 482 nm.
- Efter läsningen, gå på "Dispenser underhåll" och välj "Empty" och Pump1 att frige alla kvarvarande lösningen tillbaka till röret.
- Flytta nu röret till en falk rör innehållande vatten och bocka för "Flush".
- Efter spolning steg, tomma röret genom att välja "Empty".
- Placera röret från Pump1 i reaktionen buffert falken röret och en från Pump2 i luciferin falk röret.
- Ändra plattan layouten.
- Välj "Fyll" för Pump1 och Pump2 från "DiSpenser Underhåll "menyn.
- Välj protokollet och starta läsning. Reaktionen mellan Firefly luciferas och dess substrat luciferin sänder ut ljus med en topp våglängd på 560 nm.
- I slutet av läsningen upprepa proceduren Empty-Flush-tom för Pump1 och Pump2.
- Resultaten finns nu tillgängliga i "Wallac 1420 Explorer".
- Varje experiment är kopplade till en analys nummer, användarnamn, börjar och slutar dagen.
- Resultaten kan nu exporteras som en Excel-fil.
- För beräkningar, är celler delas in i tre grupper: 1. icke-chockade referensexemplar (in som 100% av refolded firefly luciferas), 2. celler utan molekylära förkläde och chockade värme, 3. celler med molekylära förkläde och värme chockad.
6. Representativa resultat
Protein vika är direkt relaterad till tidpunkten för återhämtningen därför att testa om systemet fungerar pro Perly har ett test som ska utföras samla in de celler vid olika tidpunkter. En direkt korrelation tid / andel vika visar att försöket har fullgjorts och utgör därför en begränsande faktor. Det bör dock alltid ansett att vika efter värme chock är ett mättar händelse och därmed en ordentlig tidsförloppet analys bör göras innan något experiment.
Figur 1. Översikt av försöket. In vivo vika analys kräver 3 till 4 dagar att slutföra. Dag 1 celler är seedade och transfekterade. Följande dag celler uppdelad i ett mindre format och på dag 3 de är värme chockad. Vid denna punkt är det möjligt att utföra luciferas analysen direkt efter skörd cellerna eller spara cellpelleten vid -80 ° C och utföra analysen i nästa ögonblick
Figur 2. Cell klyvning. Dag 2 celler delas upp i en 6-brunnar. Varje transfektion kommer att spädas ut i en brunn för att få alla transfektion på samma tallrik. Varje platta kommer att motsvara en viss återhämtningstid plus en icke-chockade referens plåt.
Figur 3. Representant bra resultat. A. Andel vika mätas direkt med eldfluga luciferas aktivitet. Varje stapel representerar andelen vika i frånvaro (svarta staplar) och i närvaro (röda staplar) med en molekylvikt förkläde vid olika återhämtningstid. B. Korrelation mellan tid och vika i frånvaro (svart linje) och närvaro (röda linjen) i förkläde. R Kvadraten visar god korrelation.
I Fig.3A visas ett representativt resultat där celler samlades 15, 30, 45, 60 och 120 minuter efter värme chock i frånvaro (svarta staplar) och i närvaro (röda staplar) av molekylära förkläde. Andel refolded luciferas ökar med förlängd återhämtningstid och med transfektion av den molekylära förkläde. Sambandet mellan vika och tiden för kontrollen (Fig. 3B, svart linje) och den molekylära förkläde-transfekterade cellerna (Fig. 3B, röd linje) visas.
Figur 4. Representant dåligt resultat. A. Andel vika direkt av luciferas aktivitet. Varje stapel representerar andelen vika i frånvaro (svarta staplar) och i närvaro (röda staplar) med en molekylvikt förkläde vid olika återhämtningstid. B. Korrelation mellan tid och vika i frånvaro och i närvaro (röda lIne) av förkläde. R Kvadraten anger dålig korrelation.
Figur 4A. Visar ett representativt resultat av ett försök inte korrekt utförda. Både kontroll (svarta staplar) och den molekylära förkläde-transfekterade celler (röda staplar) inte visade en ökning av protein vika med tiden. Dessutom gjorde transfektion av de molekylära förkläde inte resultera i en ökning av vika. Denna stackars samband bekräftas i figur. 4B visar en R-kvadrat värde på 0,6619 och 0,1882 respektive för kontroll (svart linje) och den molekylära förkläde-transfekterade celler (röd linje).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete ett protokoll för att mäta intracellulära vika aktivitet molekylär följeslagare presenteras. Hela analysen kan utföras på 3 till 4 dagar vilket framgår av översikten i figur. 1.
Robusthet och linjäritet ljussignal produceras av eldfluga och renilla luciferas utgör en solid grund för reproducerbarhet i protokollet.
Den kritiska steg i analysen är valet av en effektiv transfektion reagens för att säkerställa att överuttryck av den molekylära förkläde och eldfluga luciferas. Reporter gener kunde levereras också med andra metoder som adenovirala infektion 12 eller elektroporation. En annan möjlighet är att använda en transgen cellinje där uttrycket av förkläde är kemiskt inducerbara (t.ex. ett tetracyklin-lyhörd promotor) 13, medan den gen av eldfluga luciferas är stabilt transfekterades. Detta breda spektrum av Options gör alltså möjligt tillämpningen av analysen till flera cellinjer, inklusive primära celler.
Dessutom, om en cell linje är särskilt känslig för cykloheximid behandlingen kunde eldfluga luciferas proteinsyntesen gripas med hjälp en repressible / inducible systemet.
Sedan vika aktivitet kan variera mellan de molekylära följeslagare, bör en titrering av den mängd förkläde som ska transfekterade alltid gjort. När väl etablerade i en viss cell linje, kan tekniken användas för att undersöka hur små molekyler och / eller gentic manipulationer kan påverka förkläde aktivitet. Analysen kan utföras även i ett mindre format, som en 6 - eller ens en 12-brunnar.
En av de mest attraktiva applikationer är möjligheten att testa hela bibliotek av substanser som kan påverka förkläde aktivitet. I det här fallet, cellinjer transfekterade stabilt med reporter genen samt lmaperone är företrädesvis används för att minimera variationer beroende på transfektion effektivitet.
Denna analys kan också användas för att undersöka vilken roll co-aktivatorer eller co-repressor av de molekylära följeslagare i protein vika eller hur de påverkar vika på olika stressen stimuli (värme, oxidativ stress, ovikta protein svar).
Även om från en cell-baserad experiment är möjligt att ha en mer fysiologisk avläsning av effekten av föreningar och / eller proteiner på aktiviteten av en viss förkläde, är det inte möjligt att kvantifiera förkläde verksamheten med analysen här presenteras. I detta fall skulle vara mer passande en cell-fri test som in vitro vika analys i Firefly luciferas eller β-galaktosidas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Danilo Maddalo är mottagare av en forskartjänst som Young Investigator Group (YIG) från Karlsruhe Institute of Technology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used |
|||
Programs for the Luminometer: |
|||
Renilla: Pump 1, 100 μl injection |
|||
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection |
|||
Luciferin: Pump2, 30μl injection |
|||
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water: |
|||
|
|||
GLY-GLY-buffer: |
|||
|
|||
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter. |
|||
Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer: |
|||
|
|||
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution. |
|||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA |
Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C–lenterazine | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 | |
References
- Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
- Ritossa, F.
- Hendrick, J. P., Hartl, F. U. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins. Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).
- Fuqua, S. A. Heat shock proteins and drug resistance. Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).
- Guzhova, I., Margulis, B. Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology. Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).
- Whitesell, L., Lindquist, S. L.
- Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G.
- Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. Targeting HSP70 for cancer therapy. Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).
- Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats. J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).
- Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).
- Thulasiraman, V., Matts, R. L. Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate. Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).
- Howarth, J. L. Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease. Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).
- Nollen, E. A. Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).
