Summary
In diesem Protokoll eine Methode, um intrazelluläre Protein Rückfaltung nach Hitzeschock Maßnahme beschrieben. Diese Methode kann verwendet werden, um foldases wie molekulare Chaperone und ihr Co-Faktoren oder Verbindungen in der Lage, ihre Tätigkeit Einfluss zu studieren. Firefly Luciferase-Aktivität wird als Reporter Chaperon Rückfaltung Aktivität zu messen.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um die enzymatische Aktivität der molekularen Chaperone in der Zelle-basierten System und die möglichen Auswirkungen von Verbindungen mit inhibitorischen / stimulierende Aktivität zu messen. Molekulare Chaperone sind Proteine, die bei der Regulation der Proteinfaltung 1 beteiligt und spielen eine entscheidende Rolle bei der Förderung der das Überleben der Zelle auf Stress Beleidigungen wie Hitzeschock 2, Nährstoff Hunger und die Exposition gegenüber Chemikalien / Gifte 3. Aus diesem Grund Chaperone gefunden werden, um in Veranstaltungen wie Tumor-Entwicklung, chemioresistance von Krebszellen 4 sowie Neurodegeneration 5 beteiligten werden. Design von kleinen Molekülen in der Lage zu hemmen oder stimulieren die Aktivität dieser Enzyme ist daher eine der am besten untersuchten Strategien zur Krebstherapie 7 und neurodegenerativen Erkrankungen 9. Der Test hier beschrieben bietet die Möglichkeit, die Rückfaltung Aktivität eines bestimmten molekularen Chaperon zu messen und die Wirkung von comp-Studieounds über ihre Tätigkeit. Bei dieser Methode wird das Gen des molekularen Chaperon untersucht wird zusammen mit einem Expressionsvektor kodiert für die Firefly-Luciferase-Gen transfiziert. Es wurde bereits beschrieben, dass denaturierte Luciferase durch molekulare Chaperone 10,11 kann gefaltet. Als Normalisierung Transfektion kontrollieren, ist ein Vektor-Codierung für die Renilla-Luciferase-Gen transfiziert. Alle Transfektionen in diesem Protokoll beschriebenen sind mit X-treme Gene 11 (Roche) in HEK-293 Zellen durchgeführt. Im ersten Schritt wird die Proteinsynthese durch Behandlung der Zellen mit Cycloheximid gehemmt. Danach Proteinentfaltung wird durch Hitzeschock bei 45 ° C für 30 Minuten induziert. Nach Wiederaufnahme bei 37 ° C, sind Proteine wieder zusammengefaltet in ihre aktive Konformation und Aktivität der Firefly-Luciferase als read-out verwendet: je mehr Licht produziert wird, desto mehr Protein wird die ursprüngliche Konformation wieder gewonnen. Non-Hitzeschock-Zellen sind als Referenz (100% des refolded gesetztLuciferase).
Protocol
1. Aussäen der Zellen
- Bevor Sie beginnen, wärmen das Kulturmedium, das PBS 1X und das Trypsin in einem Wasserbad bei 37 ˚ C
- Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und saugen das Medium.
- Sanft gelten 5 ml PBS 1X auf die Zellen, um sie zu waschen.
- Saugen Sie das PBS 1X und gelten 1 ml Trypsin enthält 0,025% EDTA.
- Vorsichtig dreht die Platte um eine gleichmäßige Verteilung des Trypsin haben.
- Legen Sie die Zellen im Brutschrank bei 37 ˚ C für 5-10 Minuten (je nach Zelltyp). Von Zeit zu Zeit überprüfen, ob Zellen werden durch Schütteln der Platte abgelöst.
- Resuspendieren der Zellen in 10-20 ml Medium und sammeln sie in einem 50 ml Falcon-Röhrchen.
- Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Beckman Zähler. Die Anzahl der Zellen sollte ausreichen, um ein Zusammenfluss von ca. 60-70% zu gewährleisten.
- Platte der Zellen und ermöglichen ihnen, Samen für 6-8 Stunden.
2. Transfection
- Vor der Transfektion Aufwärmen ein Aliquot von Serum-freiem Medium in einem Wasserbad bei 37 ˚ C.
- Bringen Sie die X-treme Gene 9 bis Raumtemperatur.
- Pipettieren der serumfreien Medium in 2 Eppendorf-Röhrchen (1 Tube = 1 Transfektion).
- Pipettieren Sie die X-treme Gene 9 in der serumfreien Medium zu achten, dass die Spitze nicht berühren Kunststoff Wand des Eppendorf und Inkubation für 5 Minuten. In der Zwischenzeit bereiten sich zwei DNA-Mix in eine Tube vermischen die Plasmide für die Renilla, Glühwürmchen und einem leeren Vektor-Steuerung, in ein anderes Rohr Renilla, Glühwürmchen und das molekulare Chaperon.
- Fügen Sie die DNA-Mix zu jedem eppendorf mit serumfreiem Medium + X-treme Gene 9, Vortex und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten.
- Fügen Sie tropfenweise jeden Mix auf jeder Platte und inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2
3. Die Aufteilung der Zellen
- 24 Stunden nach der Transfektion trypsinize die Zellen wie unter 1.4 beschrieben - 1,6 und verdünnen, um eine endgültige Konfluenz von 60-70% in einer 6-Well-Platte.
- Bereiten Sie eine Platte für die Nicht-Schock-Steuerung und so viele Platten wie die Recovery-Zeit Punkte, die analysiert werden müssen, wie gezeigt, in Abb.. 2.
4. Heat shock
- Für Hitzeschock, pre-warm serum-haltigem Medium in einem Wasserbad bei 37 ˚ C.
- Bereiten Sie "Hitzeschock-Puffer" durch Verdünnung in serum-haltigem Medium Cycloheximid zu einer Endkonzentration von 20 ug / ml und MOPS bis 20 mM.
- Jetzt nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und saugen das Medium.
- Fügen Sie in jede Vertiefung 1 ml 'Heat Shock Puffer', und inkubieren für 30 Minuten bei 37 ˚ C und 5% CO 2 (enthält auch die Referenz-Platte in dieser Behandlung). Dies wird de novo Proteinsynthese zu stoppen.
- In der Zwischenzeit Schalter auf einem Wasserbad und stellen Sie die temperatur bei 45 ˚ C.
- Nach der Inkubation, verschließen Sie die Deckel der Platten mit Parafilm zuvor geschnitten in Streifen. Die Referenz Platte (100% der refolfed firefly) ist in den Inkubator verlassen.
- Die Inkubation bei 45 ˚ C für 30 Minuten.
- Entfernen Sie die Platten aus dem Wasserbad, entfernen Sie die Parafilm und stellte die Teller zurück in den Inkubator, um Erholung zu ermöglichen.
- Zu jedem Zeitpunkt der Ernte der Zellen und waschen Sie sie in PBS 1X durch Zentrifugation bei 2000Xg für 1 Minute bei 4 ˚ C.
5. Zelllyse und Luciferase-Assay
- Für eine effiziente Lyse, Snap freeze das Zellpellet in flüssigem Stickstoff.
- Add 200 ul der passiven Lysepuffer verdünnt 1:5 in doppelt destilliertem Wasser in einem Glasrohr.
- Add 30 ul Zelllysat in einer 96-Well-Platte. Jede Probe wird in dreifacher Ausführung pipettiert.
- Nur die "nicht schockiert" Referenzproben verwendet werden, umLesen Sie Renilla-Luciferaseaktivität, da dieser Schritt wird verwendet, um gleich Transfektionseffizienz zu überprüfen.
- Bereiten Sie die Lösungen für den Test. Für das Luciferin-Lösung verdünnt Luciferin zu einer Endkonzentration von 0,2 mM in Gly-Gly-Puffer. Für die Reaktion Puffer verdünnt, DTT und ATP zu 1mm Endkonzentration in Gly-Gly-Puffer. Für Coelenterazin Reaktionspuffer verdünnen Coelenterazin zu einer Endkonzentration von 0,2 uM in Coelenterazin Puffer. Keep Luciferin-Lösung und Coelenterazin Reaktionspuffer Licht geschützt.
- Setzen Sie nun den 96-Well-Platte in das Luminometer und starten Sie das Programm 'Wallac 1420 Workstation ".
- Führen Sie das Pump1 in das Falcon-Röhrchen mit dem Coelenterazin-Lösung. Schließen Sie den Deckel so kein Licht in Kontakt mit dem Rohr kommen.
- Wählen Sie aus dem Menü die Option 'Dispenser Wartung "und kreuzen Sie Pump1.
- Wählen Sie die Option "Fill".
- So bearbeiten Sie die Platte Layout wählen Sie die Option 'Explore-Protokoll und die Ergebnisse "auf der Speisekarte. Wählen Sie das Protokoll, und doppelklicken Sie darauf. Wählen Sie nun den Brunnen zu lesen.
- Zurück zu "Wallac Manager 'und klicken Sie auf' Start '. Die Reaktion zwischen dem Renilla-Luciferase und seinem Substrat Coelenterazin emittiert Licht mit einer Peak-Wellenlänge von 482 nm auf.
- Nach der Lesung zum Thema "Dispenser Wartung" und wählen Sie "Leer" und Pump1 alle der verbleibenden Lösung zurück Freisetzung in die Röhre.
- Bewegen Sie nun den Schlauch zu einem Falcon-Röhrchen mit Wasser und kreuzen Sie 'Flush'.
- Nach dem Spülschritt, leeren Sie den Schlauch durch die Auswahl "Empty".
- Das Röhrchen aus Pump1 im Reaktionspuffer Falcon-Röhrchen und der von Pumpe 2 in das Luciferin Falcon-Röhrchen.
- Ändern Sie die Platte Layout.
- Wählen Sie "Fill" für Pump1 und Pumpe 2 aus dem 'Dispenser Maintenance "-Menü.
- Wählen Sie das Protokoll und starten Sie das Lesen. Die Reaktion zwischen dem Firefly Luciferase und ihr Substrat Luciferin emittiert Licht mit einer Peak-Wellenlänge von 560 nm auf.
- Am Ende der Lesung wiederholen Sie den Vorgang Empty-Flush-Empty für Pump1 und Pumpe2.
- Die Ergebnisse sind nun in der 'Wallac 1420 Explorer "zur Verfügung.
- Jeder Versuch, einen Assay-Nummer zugeordnet ist, username, Beginn und Ende Datum.
- Die Ergebnisse können nun als Excel-Datei exportiert werden.
- 1: Für die Berechnungen werden die Zellen in drei Gruppen eingeteilt. nicht schockiert Referenzproben (als 100% des refolded Glühwürmchenluciferase), 2. Zellen ohne molekulares Chaperon und Hitzeschock, 3. Zellen mit molekularen Chaperon und Hitzeschock.
6. Repräsentative Ergebnisse
Rückfaltungsmethoden wird direkt an den Zeitpunkt der Wiederherstellung daher zu prüfen, im Zusammenhang, wenn das System arbeitet pro Perly, hat einen Test durchgeführt Sammeln der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten werden. Eine direkte Korrelation Zeit / Anteil der Rückfaltung zeigt an, dass das Experiment wurde ordnungsgemäß durchgeführt und stellt somit ein limitierender Faktor. Es sollte jedoch immer berücksichtigt werden, dass Rückfaltung nach Hitzeschock ist eine Sättigung Veranstaltung und daher eine angemessene zeitliche Verlauf Analyse sollte vor Beginn eines jeden Experiments durchgeführt werden.
Abbildung 1. Übersicht des Experiments. In vivo Rückfaltung Test erfordert 3 bis 4 Tagen abgeschlossen sein. Am Tag 1 Zellen ausgesät und transfiziert. Der folgende Tag-Zellen werden in einem kleineren Format aufgeteilt und an Tag 3 sind sie Hitzeschock. An dieser Stelle besteht die Möglichkeit, die Luciferase-Assay direkt nach der Ernte der Zellen durchzuführen oder das Zellpellet bei -80 ° C zu sparen und führen Sie die Tests in einem anderen Moment
Abbildung 2. Zellteilung. Am Tag 2 Zellen in einer 6-Well-Platte aufgeteilt. Jede Transfektion wird in einem gut verdünnt werden, um all die Transfektion auf der gleichen Platte haben. Jede Platte wird auf einen bestimmten Erholungszeit und einem nicht schockiert Referenzplatte entsprechen.
Abbildung 3. Representative gutes Ergebnis. A. Anteil der Rückfaltung direkt von Firefly-Luciferaseaktivität gemessen. Jeder Balken stellt den Prozentsatz der Rückfaltung in Abwesenheit (schwarze Balken) und in Anwesenheit (rote Balken) von einem molekularen Chaperon an verschiedenen Recovery-Zeit Punkte. B. Zusammenhang zwischen Zeit und Rückfaltung in Abwesenheit (schwarze Linie) und in Anwesenheit (rote Linie) von Chaperon. Die r quadrierten Werte zeigen eine gute Korrelation.
In Fig.3A ist eine repräsentative Ergebnisse, wo Zellen 15, 30, 45, 60 und 120 Minuten nach Hitzeschock in Abwesenheit (schwarze Balken) und in Anwesenheit (rote Balken) der molekularen Chaperon gesammelt wurden gezeigt. Anteil der refolded Luciferase steigt mit längerer Erholungszeit und die Transfektion der molekularen Chaperon. Die Korrelation zwischen Rückfaltung und Zeit für die Kontrolle (Abb. 3B, schwarze Linie) und der molekularen Chaperon-transfizierten Zellen (Abb. 3B, rote Linie) gezeigt.
Abbildung 4. Representative schlechtes Ergebnis. A. Anteil der Rückfaltung direkt von Luciferaseaktivität gemessen. Jeder Balken stellt den Prozentsatz der Rückfaltung in Abwesenheit (schwarze Balken) und in Anwesenheit (rote Balken) von einem molekularen Chaperon an verschiedenen Recovery-Zeit Punkte. B. Zusammenhang zwischen Zeit und Rückfaltung in Abwesenheit und in Anwesenheit (rot line) von Chaperon. Die r quadrierten Werte zeigen schlechte Korrelation.
Abbildung 4A. Zeigt eine repräsentative Ergebnis eines Experiments nicht ordnungsgemäß ausgeführt. Sowohl die Steuerung (schwarze Balken) und der molekularen Chaperon-transfizierten Zellen (rote Balken) nicht zeigen einen Anstieg der Protein-Faltung mit der Zeit. Darüber hinaus hat die Transfektion der molekularen Chaperon nicht zu einer Erhöhung der Rückfaltung führen. Diese schwache Korrelation ist in Abb. bestätigt. 4B zeigt eine r Quadrat-Wert von 0,6619 und 0,1882 jeweils für die Kontrolle (schwarze Linie) und der molekularen Chaperon-transfizierten Zellen (rote Linie).
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Discussion
In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur intrazellulären Rückfaltung Aktivität der molekularen Chaperone Maßnahme vorgestellt. Der ganze Test kann in 3 bis 4 Tagen durchgeführt werden, wie die Übersicht in Abb. gezeigt. 1.
Die Robustheit und Linearität des Lichtsignals durch die Glühwürmchen und die Renilla-Luciferase produziert stellen eine solide Basis für die Reproduzierbarkeit des Protokolls.
Der entscheidende Schritt des Tests ist die Wahl eines effizienten Transfektionsreagenz auf die Überexpression der molekularen Chaperon und der Glühwürmchen-Luciferase gewährleisten. Reporter Gene könnten auch mit anderen Methoden wie Adenovirus-Infektion 12 oder Elektroporation geliefert werden. Eine andere Möglichkeit ist die Verwendung eines transgenen Zelllinie, wo der Ausdruck des Chaperon ist chemisch induzierbaren (zB Tetracyclin-responsive Promotor) 13, während das Gen der Firefly Luciferase stabil transfiziert ist. Diese breite Palette von options macht es möglich die Anwendung des Tests auf mehrere Zelllinien, einschließlich Primärzellen.
Außerdem, wenn eine Zelllinie ist besonders empfindlich gegenüber Cycloheximid Behandlung konnte Glühwürmchenluciferase Protein Übersetzung durch den Einsatz eines reprimierbaren / induzierbare System verhaftet werden.
Da Rückfaltung Aktivität unter den molekularen Chaperone variieren kann, sollte eine Titration der Menge der Chaperon transfiziert werden immer durchgeführt werden. Sobald in einer bestimmten Zelllinie etabliert, kann die Technik verwendet werden, um zu untersuchen, wie kleine Moleküle und / oder gentic Manipulationen können Chaperon-Aktivität beeinflussen werden. Der Test kann auch in einem kleineren Format durchgeführt werden, wie ein 6 - oder sogar eine 12-Well-Platte.
Eines der attraktivsten Anwendungen ist die Möglichkeit, ganze Bibliotheken von Verbindungen, die Chaperon-Aktivität beeinflussen können testen. In diesem speziellen Fall, Zelllinien stabil mit dem Reporter-Gen sowie die ch transfiziertenaperone werden bevorzugt eingesetzt, um Schwankungen aufgrund von Transfektionseffizienz zu minimieren.
Dieser Test kann auch verwendet werden, um die Rolle des Co-Aktivatoren oder Co-Repressor der molekularen Chaperone in Rückfaltungsmethoden oder wie sie Einfluss Rückfaltung auf verschiedene Stress-Stimuli (Hitze, oxidativer Stress, entfaltete Protein Response) zu untersuchen.
Selbst wenn von einem zell-basierte Experiment ist möglich, eine weitere physiologische Auslesen der die Wirkung von Verbindungen und / oder Proteine auf der Aktivität eines bestimmten Chaperon haben, ist es nicht möglich, die Chaperon-Aktivität mit dem Test hier vorgestellt zu quantifizieren. In diesem Fall wäre besser geeignet einem zellfreien Assay wie in vitro Rückfaltung Assay von firefly Luciferase oder β-Galactosidase.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Danilo Maddalo ist ein Empfänger ein Forschungsstipendium als Young Investigator Group (YIG) aus dem Karlsruhe Institute of Technology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used |
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Programs for the Luminometer: |
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Renilla: Pump 1, 100 μl injection |
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Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection |
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Luciferin: Pump2, 30μl injection |
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For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water: |
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GLY-GLY-buffer: |
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For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter. |
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Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer: |
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For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution. |
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| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA |
Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C–lenterazine | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 | |
References
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