Summary
In questo protocollo un metodo per misurare ripiegamento delle proteine intracellulari dopo shock termico è descritto. Questo metodo può essere utilizzato per studiare foldases come chaperon molecolari e la loro co-fattori o composti in grado di influenzare la loro attività. Attività Firefly luciferasi viene utilizzato come reporter per misurare l'attività ripiegamento accompagnatore.
Abstract
Questo protocollo descrive un metodo per misurare l'attività enzimatica di chaperon molecolare in una cella e sistemi basati su possibili effetti di composti con attività inibitoria / stimolante. Chaperon molecolari sono proteine coinvolte nella regolazione di protein folding 1 e hanno un ruolo cruciale nel promuovere la sopravvivenza delle cellule su insulti dello stress come heat shock 2, la fame di nutrienti e l'esposizione a sostanze chimiche / veleni 3. Per questo motivo accompagnatori si trovano ad essere coinvolti in eventi come lo sviluppo del tumore, chemioresistance delle cellule tumorali 4, nonché neurodegenerazione 5. Progettazione di piccole molecole in grado di inibire o stimolare l'attività di questi enzimi è quindi una delle strategie più studiate per la terapia del cancro 7 e malattie neurodegenerative 9. Il test qui descritto offre la possibilità di misurare l'attività ripiegamento di un chaperone molecolare particolare e per studiare l'effetto di compounds sulla sua attività. In questo metodo il gene del chaperone molecolare indagato è transfettate con una codifica espressione vettore per il gene della luciferasi lucciola. E 'stato già descritto che denaturato luciferasi lucciola può essere ripiegata da chaperon molecolare 10,11. Come normalizzare il controllo transfezione, un vettore di codifica per il gene della luciferasi è Renilla transfettate. Tutti trasfezioni descritto in questo protocollo vengono eseguiti con X-treme Gene 11 (Roche) in cellule HEK-293. Nella prima fase, la sintesi proteica è inibita trattando le cellule con cicloesimide. Successivamente le proteine svolgimento è indotto da shock termico a 45 ° C per 30 minuti. Dopo il recupero a 37 ° C, le proteine sono ri-piegati nella loro conformazione attiva e l'attività della luciferasi lucciola è usato come read-out: la luce più sarà prodotto, la proteina più avrà riguadagnato la conformazione originale. Cellule scioccato non-calore sono impostati come riferimento (100% del ripiegatoluciferasi).
Protocol
1. Semina le cellule
- Prima di iniziare, riscaldare il terreno di coltura, la PBS 1X e la tripsina a bagnomaria a 37 ˚ C
- Prendete le cellule fuori dell'incubatore e aspirare il terreno.
- Applicare delicatamente 5 ml di PBS 1X sulle cellule di lavarli.
- Aspirare il PBS 1X e applicare 1 ml di tripsina contenente 0,025% EDTA.
- Ruotare delicatamente la piastra per avere una distribuzione uniforme della tripsina.
- Mettere le cellule nell'incubatore a 37 ˚ C per 5-10 minuti (a seconda del tipo di cellula). Di volta in volta verificare se le cellule sono staccati agitando il piatto.
- Risospendere le cellule in 10-20 ml di medie e raccoglierle in un tubo di 50 ml falco.
- Contare le celle utilizzando un contatore Beckman. Il numero di cellule dovrebbe essere sufficiente a garantire una confluenza di circa il 60-70%.
- Piatto le cellule e permettere loro di semi per 6-8 ore.
2. Transperfezione
- Prima di transfezione, scaldare una aliquota del mezzo privo di siero in un bagnomaria a 37 ˚ C.
- Portare la X-treme Gene 9 a temperatura ambiente.
- Pipettare il medium siero libero in 2 tubi eppendorf (1 tubo = 1 trasfezione).
- Preparare la X-treme Gene 9 nel siero attenzione di media liberi a pagamento che la punta non toccare la parete di plastica del Eppendorf e incubare per 5 minuti. Nel frattempo preparare due mix del DNA: in una provetta mescolare insieme i plasmidi per Renilla, lucciola e un controllo vettore vuoto, in un altro tubo Renilla, lucciola e il chaperone molecolare.
- Aggiungere il mix di DNA per ogni eppendorf contenenti siero di media liberi + X-treme Gene 9, vortex e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.
- Aggiungere goccia a goccia ogni mix su ogni piastra e incubare per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2
3. Dividere le cellule
- 24 ore dopo la trasfezione, trypsinize le cellule, come descritto nella 1,4-1,6 e diluire ad una confluenza finale del 60-70% in un 6-pozzetti.
- Preparare una piastra per la mancata scioccato di controllo e, come molti piatti come punti di tempo di recupero che devono essere analizzati, come mostrato in fig. 2.
4. Colpo di calore
- Per shock termico, pre-riscaldare siero contenente medie in un bagnomaria a 37 ˚ C.
- Preparare 'buffer di calore shock' diluendo nel siero cicloeximide supporto contenente una concentrazione finale di 20 mg / ml e MOPS a 20 mm.
- Ora togliere i piatti dal termostato e aspirare il terreno.
- Aggiungere ad ogni pozzetto 1 ml di 'tampone Colpo di calore', e incubare per 30 minuti a 37 ˚ C e 5% di CO 2 (comprende anche la piastra di riferimento in questo trattamento). Questo fermerà de novo sintesi proteica.
- Nel frattempo lo switch su un bagnomaria e impostare il temperatura a 45 ˚ C.
- Dopo l'incubazione, sigillare il coperchio delle piastre con Parafilm precedentemente tagliati a strisce. La piastra di riferimento (100% del refolfed lucciola) viene lasciato in incubatrice.
- Incubare le piastre a 45 ˚ C per 30 minuti.
- Rimuovere le piastre dal bagnomaria, togliere il parafilm e mettere i piatti nuovo al incubatore per permettere il recupero.
- Ad ogni vendemmia punto volta le cellule e lavarli in PBS 1X per centrifugazione a 2000Xg per 1 minuto a 4 ˚ C.
5. Lisi delle cellule e saggio luciferasi
- Per una lisi cellulare efficiente, scatto congelare il pellet di cellule in azoto liquido.
- Aggiungere 200 ml di tampone di lisi passivo diluito 1:5 in acqua bidistillata in un tubo di vetro.
- Aggiungere 30 ml di lisato di cellule in una piastra da 96 pozzetti. Ogni campione è pipettati in triplice copia.
- Solo la 'non scioccato' campioni di riferimento sarà utilizzato perleggere le attività Renilla luciferasi, in quanto questo passaggio viene utilizzato per verificare l'efficienza pari trasfezione.
- Preparare le soluzioni per l'analisi. Per la soluzione diluita luciferina luciferina ad una concentrazione finale di 0,2 mM in Gly-Gly buffer. Per il buffer di reazione diluita DTT e ATP alla concentrazione finale di 1 mM Gly-Gly buffer. Per il buffer coelenterazine reazione, diluire coelenterazine ad una concentrazione finale di 0,2 mM in tampone coelenterazine. Tenere la soluzione e la reazione luciferina luce coelenterazine tampone protetta.
- Ora la piastra a 96 pozzetti nel luminometro e avviare il programma 'Wallac 1420 Workstation'.
- Introdurre il Pump1 nella provetta contenente la soluzione falco coelenterazine. Chiudere il coperchio in modo da nessuna luce può entrare in contatto con il tubo.
- Scegliete dal menu 'di manutenzione Dispenser' e spuntare l'opzione Pump1.
- Selezionare l'opzione 'Riempi'.
- Per modificare il layout della piastra di scegliere l'opzione 'Esplora il protocollo ed i risultati' dal menu. Selezionare il protocollo e doppio click su di esso. Ora selezionare i pozzi da leggere.
- Torna alla 'Wallac Manager' e fare clic su 'Start'. La reazione tra il luciferasi Renilla e il suo substrato coelenterazine emette luce con lunghezza d'onda di picco di 482 nm.
- Dopo la lettura, andare su 'manutenzione Dispenser' e selezionare 'vuoti' e Pump1 di rilasciare tutti la soluzione residua nuovo al tubo.
- Ora spostare il tubo in una provetta contenente acqua falco e spuntare 'Flush'.
- Dopo la fase di lavaggio, svuotare il tubo selezionando 'vuoto'.
- Posizionare il tubo dal Pump1 nel tubo tampone di reazione falco e quella da Pump2 nel tubo luciferina falco.
- Modificare il layout della piastra.
- Selezionare 'Riempi' per Pump1 e Pump2 dal 'Dimenù Spenser Manutenzione '.
- Selezionare il protocollo e iniziare la lettura. La reazione tra il luciferasi Firefly e il suo substrato luciferina emette luce con lunghezza d'onda di picco di 560 nm.
- Al termine della lettura ripetere la procedura di Empty-Flush-vuoto per Pump1 e Pump2.
- I risultati sono ora disponibili nel 'Wallac 1420 Explorer'.
- Ogni esperimento è associato ad un numero test, username, data di inizio e fine.
- I risultati possono ora essere esportati come file Excel.
- Per i calcoli, le cellule si dividono in tre gruppi: 1. non scioccato campioni di riferimento (insieme al 100% del ripiegato lucciola luciferasi), 2. cellule senza chaperone molecolare e calore scioccato, 3. cellule con chaperone molecolare e calore scioccato.
6. Rappresentante Risultati
Ripiegamento delle proteine è direttamente correlato al tempo di recupero quindi per verificare se il sistema funziona pro Perly, un saggio deve essere effettuata la raccolta delle cellule in diversi momenti. Una diretta correlazione tempo / percentuale di ripiegamento indica che l'esperimento è stato eseguito correttamente e rappresenta quindi un fattore limitante. Tuttavia va sempre considerato che il ripiegamento dopo la scossa di calore è un evento saturare e quindi una corretta analisi andamento temporale deve essere eseguita prima di iniziare qualsiasi esperimento.
Figura 1. Panoramica dell'esperimento. Test in ripiegamento in vivo richiede 3 o 4 giorni per essere completata. Il giorno 1 le cellule vengono seminate e transfettate. Le cellule giorno seguente sono suddivisi in un formato più piccolo e il giorno 3 sono scioccati calore. A questo punto è possibile eseguire il test luciferasi subito dopo la raccolta delle cellule o per salvare il pellet a -80 ° C ed eseguire il test in un altro momento
Figura 2. Suddivisione cellulare. Il giorno 2 celle sono divisi in un 6-pozzetti. Ogni trasfezione sarà diluito in un pozzo in modo da avere tutti i trasfezione sulla stessa piastra. Ogni piatto corrisponde ad un particolare tempo di recupero più un non-scioccato piastra di riferimento.
Figura 3. Rappresentante buon risultato. A. Percentuale di ripiegamento misurata direttamente mediante attività lucciola luciferasi. Ogni grafico a barre rappresenta la percentuale di ripiegamento in assenza (barre nere) e in presenza (barre rosse) di un chaperone molecolare in diversi punti il tempo di recupero. B. Correlazione tra tempo e ripiegamento in assenza (linea nera) e in presenza (linea rossa) di accompagnatore. I valori di r quadrato indicano buona correlazione.
In Fig.3A è indicato un rappresentante, se i risultati sono stati raccolti cellule minuti 15, 30, 45, 60 e 120 dopo la scossa di calore in assenza (barre nere) e in presenza (barre rosse) di chaperone molecolare. Percentuale di luciferasi ripiegato aumenta con il tempo di recupero prolungato e con la transfezione del chaperone molecolare. La correlazione tra il ripiegamento e il tempo per il controllo (Fig. 3B, linea nera) e il chaperone molecolare transfettate cellule (Fig. 3B, linea rossa) viene visualizzato.
Figura 4. Rappresentante risultato negativo. A. Percentuale di ripiegamento misurata direttamente mediante l'attività luciferasi. Ogni grafico a barre rappresenta la percentuale di ripiegamento in assenza (barre nere) e in presenza (barre rosse) di un chaperone molecolare in diversi punti il tempo di recupero. B. Correlazione tra tempo e ripiegamento in assenza ed in presenza (rosso l) ina di accompagnatore. I valori di r quadrato indicano correlazione negativa.
Figura 4A. Evidenzia un risultato rappresentativo di un esperimento non eseguite correttamente. Sia il controllo (barre nere) e la molecolari chaperone transfettate cellule (barre rosse) non hanno mostrato un aumento del ripiegamento delle proteine con il tempo. Inoltre, la trasfezione di chaperone molecolare non ha comportato un aumento di ripiegamento. Questa scarsa correlazione è confermata in fig. 4B che mostra un valore di R quadro di 0,6619 e 0,1882 rispettivamente per il controllo (linea nera) e la molecolari chaperone transfettate cellule (linea rossa).
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Discussion
In questo lavoro un protocollo per misurare l'attività intracellulare ripiegamento di chaperon molecolare è presentato. Il dosaggio intero può essere eseguita in 3 o 4 giorni come mostrato dalla visione d'insieme in fig. 1.
La robustezza e la linearità del segnale luminoso prodotto dalla lucciola e la luciferasi Renilla rappresentano una solida base per la riproducibilità del protocollo.
La fase critica del saggio è la scelta di un reagente di trasfezione efficiente per garantire la sovraespressione del chaperone molecolare e la luciferasi lucciola. Geni reporter possono essere consegnati anche con altri metodi come 12 infezioni adenovirali o elettroporazione. Un'altra possibilità è l'utilizzo di una linea cellulare transgenica in cui l'espressione del chaperone è chimicamente inducibile (ad esempio un promotore tetraciclina-sensibile) 13, mentre il gene della luciferasi della lucciola è stabilmente transfettate. Questa vasta gamma di Options rende così possibile l'applicazione del test di linee cellulari diverse, incluse le cellule primarie.
Inoltre, se una linea cellulare è particolarmente sensibile al trattamento cicloeximide, traduzione di proteine lucciola luciferasi potrebbe essere arrestato dalla utilizzare un reprimibile / sistema inducibile.
Poiché l'attività ripiegamento può variare tra i chaperon molecolare, una titolazione della quantità di accompagnatore per essere transfettate dovrebbe essere sempre fatto. Una volta stabilito in una linea cellulare particolare, la tecnica può essere usata per studiare come piccole molecole e / o manipolazioni gentic possono influenzare l'attività accompagnatore. Il test può essere eseguito anche in un formato più piccolo, come un 6 - o anche un 12-pozzetti.
Una delle applicazioni più interessanti è la possibilità di testare intere librerie di composti che possono influenzare l'attività di accompagnatore. In questo caso particolare, le linee cellulari stabilmente trasfettate con il gene reporter e il chaperone sono preferenzialmente utilizzati, al fine di minimizzare le variazioni dovute alla efficienza di trasfezione.
Questo test può essere utilizzato anche per studiare il ruolo di co-attivatori o co-repressore della chaperon molecolare in ripiegamento delle proteine o come influenzano ripiegamento sugli stimoli di stress differenti (calore, lo stress ossidativo, la risposta spiegato proteine).
Anche se da un cell-based esperimento è possibile avere una lettura più fisiologico degli effetti di composti e / o proteine sulla attività di un accompagnatore particolare, non è possibile quantificare l'attività di accompagnatore con il saggio qui presentato. In questo caso sarebbe più adatta una cellula priva di test come test in vitro ripiegamento luciferasi di lucciola o β-galattosidasi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Danilo Maddalo è un destinatario di una borsa di ricerca come Gruppo Young Investigator (YIG) presso l'Istituto di tecnologia di Karlsruhe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used |
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Programs for the Luminometer: |
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Renilla: Pump 1, 100 μl injection |
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Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection |
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Luciferin: Pump2, 30μl injection |
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For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water: |
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GLY-GLY-buffer: |
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For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter. |
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Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer: |
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For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution. |
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| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA |
Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C–lenterazine | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 | |
References
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