Vi har utviklet et flowcytometer bruker laser indusert ultralyd til å påvise sirkulerende melanoma celler som en tidlig indikator på metastatisk sykdom.
Sirkulerende tumorceller (CTCs) er de cellene som har skilt fra en makroskopisk tumor og spres gjennom blod og lymfe-systemer til frø sekundære svulster 1,2,3. CTCs er indikatorer av metastatisk sykdom og deres oppdagelse i blodprøver kan brukes til å diagnostisere kreft og overvåke pasientens respons på behandlingen. Siden CTCs er sjeldne, bestående om en svulst celle blant milliarder av normale blodceller i avanserte kreftpasienter, deres påvisning og telling er en vanskelig oppgave. Vi utnytter tilstedeværelsen av pigment i de fleste melanom cellene til å generere photoacoustic, eller laser indusert ultrasoniske bølger i en egendefinert flowcytometer for påvisning av sirkulerende melanom celler (CMCs) 4,5. Denne prosessen innebærer å skille en fullblodsprøve bruker sentrifugering og innhenting av hvite blodlegemer lag. Hvis stede i fullblod, vil CMCs skille med de hvite blodcellene grunn til lignende tetthet. Disse cellene er resuspendert ifosfatbufret saltvann (PBS) og introdusert i strømningsmåleren. Snarere enn en kontinuerlig strøm av blod cellesuspensjonen, induserte vi to fase strøm for å fange opp disse cellene for videre studier. I to fase strøm, to blandbare væsker i en microfluidic system møtes på et knutepunkt og danne vekslende slugs av flytende 6,7. PBS suspendert hvite blodlegemer og luft danner mikroliter slugs som er sekvensielt bestrålt med laserlys. Tillegg av en surfactant til væskefasen lar uniform slug formasjon og brukeren kan opprette forskjellige størrelser slugger ved å endre forbruk av de to fasene. Snegler av luft og snegler av PBS med hvite blodceller inneholder ingen lys absorbenter og dermed ikke produserer photoacoustic bølger. Men slugs av hvite blodceller som inneholder enda enkelt CMCs absorbere laserlys og produserer høyfrekvente akustiske bølger. Disse snegler som genererer photoacoustic bølger er isolert og samlet for cytochemical farging for verificasjon av CMCs.
Oppdage CTCs er fortsatt et forsknings-intensive felt med svært få kliniske applikasjoner på grunn av vanskelige problemet med å isolere de sjeldne kreftceller. Mange andre teknikker blir evaluert for CTC deteksjon, inkludert RT-PCR, microfluidic celle fangst, immunomagnetiske fangst, og andre metoder 8-12. Men photoacoustic deteksjon av CMCs viser løfte som det er etiketten gratis og gir en rask og nøyaktig måte å fange små, lette å absorbere partikler.
Protokollen er beskrevet å isolere hvite blodlegemer er svært effektiv, men likevel et lavt antall røde blodceller finnes i prøven. Disse rouge forurensende cellene også absorbere laserlys, men på et sterkt redusert nivå. For å sikre de røde blodcellene ikke forstyrre våre melanom detection system ble fem sunne pasientprøver introdusert gjennom systemet, og ingen ga et signal, som indikerer at røde blod celler er til stede ved lave nok konsentrasjoner til åses bort fra.
En rekke konsentrasjon studier har vært utført med dyrkede melanom celler og photoacoustic flow system har vist seg sensitiv ned til en celle / mL (upubliserte data). Disse studiene er på gang og snart vil omfatte forsøk med kreft pasientprøver.
Dette photoacoustic teknikken blir også evaluert for bruk i ikke-pigmenterte CTCs, som brystkreft og prostatakreft ved å feste eksogene chromophores. Vi har utført forberedende arbeid med gull nanopartikler på kreft cells13. Disse testene har vist at nanopartikler kan gi den nødvendige optiske absorpsjon å generere photoacoustic bølger. De resterende tekniske utfordringen er å knytte slike partikler til kreftceller selektivt.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner støtte fra Department of Biological Engineering og Christopher S. Bond Life Sciences Center ved University of Missouri. Vi erkjenner stipend støtte fra Missouri Livet Sciences Research Board 09-1034 og NIH R21CA139186-0. Vi takker også de miljø-og biovitenskap Undergraduate Research Opportunity Program ved University of Missouri, University of Missouri Molecular Cytologi Core, og University of Missouri College of Engineering for økonomisk støtte.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM | Invitrogen | ABCD1234 |