Sirkülasyon Melanom Hücreler foto akustik flowmetre kullanarak Algılama ve İzolasyonu

Summary

Biz lazer kaynaklı ultrason kullanılarak dolaşımdaki melanom hücrelerinin metastatik hastalığın erken bir göstergesi olarak algılamak için bir akış sitometresinin geliştirdik.

Abstract

Dolaşımdaki tümör hücreleri (nedenle kapalı zaman eğrileri), makroskopik tümör ayrılmış ve kan ve lenf sistemleri tohum ikincil ^tümörler 1,2,3 yoluyla yayılan bu hücrelerdir . Nedenle kapalı zaman eğrileri metastatik hastalığı ve kan örnekleri algılama göstergeleri kanser teşhis ve hastanın tedaviye yanıtı izlemek için kullanılıyor olabilir. Nedenle kapalı zaman eğrileri nadir olduğundan, bir tümör ileri evre kanser hastalarında, normal kan hücreleri milyarlarca arasında hücre, bunların tespiti ve sayımı ile ilgili oluşan zor bir iştir. Foto akustik oluşturmak için en melanom hücrelerinde pigment varlığı istismar veya lazer, ultrasonik dalgalar dolaşan melanom hücrelerinin ^(CMCs) 4,5 tespiti için özel bir akış sitometresi indüklenen . Bu süreç, santrifüj kullanılarak ve beyaz kan hücre tabakasından elde tam kan örneği ayıran gerektirir. Varsa tam kan, CMCs beyaz kan hücreleri ile benzer yoğunluğu nedeniyle ayrı olacaktır. Bu hücreler yeniden süspansefosfat tamponlu salin (PBS) ve debimetre içine tanıtıldı. Kan hücre süspansiyonu sürekli bir akış yerine, daha fazla çalışma için bu hücreleri yakalamak için iki faz akış kaynaklı. İki fazlı akış, bir mikroakışkan sistemde iki karışmayan sıvılar sıvı ^6,7 salyangozlar bir alternatif kavşak ve form buluşuyor. PBS, sırayla, lazer ışığı ile ışınlanmış beyaz kan hücreleri ve hava form mikrolitrelik salyangozlar askıya aldı. Sıvı faz bir yüzey yanı sıra düzgün sümüklü böcek oluşumunu sağlar ve kullanıcı iki faz akış oranları değiştirerek farklı büyüklükteki salyangozlar oluşturabilirsiniz. Beyaz kan hücreleri ile hava ve PBS salyangozlar salyangozlar ışık emiciler içeren ve dolayısıyla, foto akustik dalgaları üretmek değil. Ancak, salyangozlar, hatta tek bir CMCs içeren beyaz kan hücrelerinin lazer ışığı emer ve yüksek frekanslı akustik dalgalar üretir. Foto akustik dalgaları oluşturan bu salyangozlar verific birikir ve Sitokimyasal boyama için toplananCMCs, ation.

Protocol

1. Kan numune hazırlama

1. Evre IV Kanser hastanın tam kan yaklaşık 10 ml, 5 ml iki vacutainers içine çizin.
2. On dakika boyunca dakikada 3.000 devrimler (rpm) tüpleri santrifüjleyin.
3. Kan numunesi üç farklı katmanları ayırmak, buffy coat denilen eritrosit, orta tabaka, alt tabaka oluşur, lökositler ve melanoma hücreleri içeren ve üst tabaka, plazma ve trombosit içerir. Buffy coat rahatsız etmeden, mümkün olduğu kadar plazma gibi çıkarın.
4. Yeri 250, iki adet 1 ml Wintrobe tüpleri Histopaque 1077 mcL.
5. 9 "Pasteur Pipet kullanarak, <500 mcL toplamak için emin olun, kalan plazma, tüm buffy coat, ve hatta en üst tabakası eritrositlerin ayıklayın.
6. Çözüm Histopaque katmanı tepesine yerleştirin ve 15 ml konik tüpler 3000 rpm'de 10 dakika süreyle Wintrobe tüpler santrifüj.
7. Kan yenidenayrı, ama bu sefer eritrositler buffy coat kolay çıkarılması için izin Histopaque ayrılmış olacak. 9 "Pasteur Pipet tüm buffy coat almak ve 2 ml Eppendorf tüp yerleştirmek için kullanın.
8. % 2 v / v Tween 20 ile 1.5 mL PBS buffy coat askıya alınması.

2. Akış Odası İnşaat

1. Akrilik bir silindir, 20 mm dış çap, 17 mm iç çapı, 8 mm ve uzun boylu alın. Birbirlerine 90 derecelik açıyla yan silindir ile üç adet 5 mm çapında delikler delin. Polimer boru üç adet (1.6 mm iç çapı 5 mm dış çapı) Kes ve delinmiş deliklerin içine koyun.
2. Su geçirmez bir mühür yapmak için akrilik halkasının alt kısmında Parafilm gerin. Parafilm akrilik halka ile sığ bir kase formları ve bir akış odası oluşturacak olan akrilamid çözüm yapacak.
3. Karşısında boru parçaları ile 1.6 mm çaplı tel askıyasadece tel ring ortasında görünür olduğundan emin birbirlerine. Üçüncü parça, 1.6 mm çapında tel ve konumu tüp asma tel 1 mm ile boru doldurun. Bu teller tüp girmesini önlemek akrilamid. Akrilamid katılaşır sonra, teller, silindirik bir akış yolu ve bir yere bırakarak, bir fiber optik konumuna çıkartılacaktır akış yolu üzerine odaklanır.
4. [20 g akrilamid (Sigma Aldrich), 0.7 g bisacrylamide (Sigma Aldrich), 100 ml distile su] küçük bir beher 5 ml hazırlanan akrilamid ekle. 0.02 g amonyum persülfat (Sigma) ölçün ve beher ekleyin. 3 dakika boyunca bir karıştırıcı ile karıştırın. Beher 20 mcL tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) ekleyin. Hızla üst dolgu, akrilik halka içine karışımı dökün. Birkaç saniye sonra, çözüm, jel, bir akış odasında kalıp yapım olacak. Dikkatlice akrilamid jel rahatsız değil emin olun, teller çekin. Akış chamber artık kullanıma hazırdır.

3. Foto akustik flowmetre set-up

1. Akustik çift ultrason jel kullanılarak doğrudan akış yolu üzerinde bir akış odasına polivinil florür piezoelektrik akustik transdüser (Panametrics).
2. Süngü Neill-Concelman (BNC) kablo kullanarak, bir RITEC Geniş Bant Alıcı-640A girişi (çıkışı, yüksek geçiren filtresi: 1 MHz Giriş Empedansı: 50 Ohm, amplifikasyon: 35 dB alçak geçiren filtre) transdüser bağlayın. Filtre çıkışı osiloskop (Tektronix TDS 2024B) bağlayın. Osiloskop tetiklemek için bir fotodiyot (Thorlabs) transdüser yakın kurmak ve bir BNC kablosu kullanarak osiloskop takılı.
3. Bir t-konnektör (Küçük Parça) akış odasının bir kola takılır. İki şırınga pompaları (Braintree Bilimsel) konektör diğer dallara bağlanır. Diğer bölüm 1 hazırlanan hücre süspansiyonu içeren bir şırınga, hava içerir. Akış oranları ayarlayın.100 mcL / dakika.
4. Akış odasının küçük tüp hava formlarının küçük bir cep kadar ayıklayın ve bu yuvaya 0.37 sayısal diyafram ile 1 mm çap çekirdekli fiber optik yerleştirin. Arabirim sinyallerini azaltmak ve akış yolu uygulanan lazer ışığı miktarı artırmak için su ile cebe doldurun. Lazer, fiber optik ve akış yolu kısa mesafe sayısal diyafram nedeniyle, doğrudan lazer önünde örnek foto akustik sinyalleri oluşturarak aynı örnek olmasını sağlamak, herhangi bir zamanda örnek bir sümüklü böcek ışın tedavisi olacaktır. Lazer enerjisi, bir spot büyüklüğü ile 7 ^mm 2 yaklaşık 28 mJ / ^cm 2 olmalıdır .
5. Iki şırınga pompaları açın. Iki karışmayan sıvılar t-kavşak yerine varınca homojen salyangozlar ve transdüser geçmiş akışı içine bölümlenmiş olacaktır.
6. Nanosaniyelik melanom hücrelerinde foto akustik dalgaları oluşturmak için lazer darbeli akan örnek ışın tedavisi. Melanin bir broadb olduğu gibive optik emici, görünür bir lazer dalga boyu kullanılabilir.
7. Bir sümüklü böcek transdüser tepesine bir sinyal osiloskop belirirse, sümüklü böcek melanom içeren ve bir koleksiyon şişenin içine bırakarak kadar sistem üzerinden takip edilmelidir.

4. İmmünositokimya

1. Cam slaytlar bunları düzeltmek amacıyla yakalanan salyangozlar sitospin 4 Santrifüj (Thermo Scientific) ele alalım. Place cam Cytofunnels slaytlar (Kahverengi Filtre Kart Thermo Scientific Shandon EZ Tek Cytofunnel) ve sitospin 4 Santrifüj içine yerleştirin. Her huni içine PBS içinde% 1 (Sigma) Bovine Serum Albumin 100 mcL koyun ve daha sonra yakalanan hücrelerin cam slaytlar sopa yardımcı olmak için 3 dakika boyunca 600 rpm'de santrifüj.
2. Santrifüj sonra, hücre örnekleri Cytofunnels ekleyin ve daha sonra 3 dakika boyunca 600 rpm'de santrifüj. Sonra bir etanol bazlı fiksatif slaytlar spreyi.
3. PBS içinde slaytları iki kez 10 dakika boyunca yıkayın.
4. Inkübasyondan sonra, birincil antikor çözeltisi ile nemlendirilmiş bir odasında oda sıcaklığında 1 saat inkübe slaytlar ve süzün. Her slayt% 1 tavşan büyüdü SMART-1 antikor fare gündeme CD-45 antikor,% 1,% 10 Keçi serumu ve% 89 PBS içermelidir.
5. Inkübasyondan sonra, slaytları PBS içinde 10 dakika üç kez yıkayın.
6. Daha sonra slaytlar fluorofor antikorlara bağlı ikincil bir antikor çözüm, inkübe edilir. Karışımı anti-tavşan antikoru% 0.05 keçi,% 0.05 'i keçi anti-fare antikor,% 0.1' keçi serumu ve% 99 PBS içerir. Slaytlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca karanlıkta inkübe edilir.
7. Inkübasyondan sonra, slaytlar, 5 dakikada üç kez PBS içinde yıkayın süzün.
8. Bir çekirdek için leke DAPI 0.1 mikrogram / mL (Invitrogen) hücreleri inkübasyon1 dakika. Sonra süzün ve slaytları PBS içinde yıkayın.
9. 20 mcL kullanarak slayt başına bir reçine bazlı montaj medya hücre örneği üzerinde lamel monte edin. Slayt korumak için şeffaf tırnak cilası ile lamel Seal. Şimdi slaytlar floresan mikroskop ile görüntülü olmaya hazırız.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1 beyaz kan hücreleri ve melanom hücrelerinin foto akustik dalga şekilleri burada gösterilmiştir. Doğasında herhangi bir pigmentasyon olan beyaz kan hücreleri, elektronik gürültü düz bir çizgi (sol) olarak, hiçbir foto akustik dalgaları ve tezahür üretmek. Pigmentli melanom hücrelerinin sağlam bir foto akustik dalga (sağda) üretir.

Şekil 2. immünositokimyasal boyama sonra, kültürlü melanom hücrelerinin bl DAPI sinyalleri gösteriyorue ise MART1 yeşil vurgulanır.

Şekil 3. CD45 lökositlerin bir göstergesi olarak, Şekil 2'de, DAPI ve MART1 görüntüleri kaplanacağı, bu rakam, bazı beyaz kan hücreleri arasında melanom hücreleri gösterir .

Discussion

Nedenle kapalı zaman eğrileri algılama nadir tümör hücreleri izole zor bir problem nedeniyle çok az sayıda klinik uygulamaları ile hala yoğun bir araştırma alanı. CTC algılama, RT-PCR, mikroakışkan hücre yakalama, immunomagnetic yakalama ve diğer yöntemlerle ^8-12 dahil pek çok diğer teknikler değerlendirilmektedir . Ücretsiz etiket ve küçük, ışık emici parçacıkları yakalamak için hızlı ve doğru bir yol sağlar Ancak, CMCs gösterir foto akustik algılama söz veriyorum.

Protokol, beyaz kan hücreleri izole etmek için açıklanan son derece verimli, ama kırmızı kan hücrelerinin az sayıda örnek var. Bu rouge kirlenmesine neden olan hücreleri de lazer ışığı emer, ancak büyük ölçüde azalmış bir düzeyde. Kırmızı kan hücreleri, bizim melanom algılama sistemi ile karışmaz sağlamak için, sistem üzerinden beş sağlıklı hasta numunelerinin getirilmiştir ve hiçbiri, kırmızı kan hücrelerinin yeterince düşük konsantrasyonlarda mevcut olduğunu gösteren bir sinyal verdidikkate alınmayacaktır.

Konsantrasyon çalışmaları bir dizi kültür melanoma hücreleri kullanarak ve foto akustik akış sistemi hassas aşağı 1 hücre / mcL (yayınlanmamış veri) olduğu kanıtlanmıştır yapılmıştır. Bu çalışmalar, devam eden ve yakında kanser hasta numuneleri kullanılarak çalışmalarda yer alacak.

Bu foto akustik tekniği de eksojen kromoforlar ekleyerek meme ve prostat kanseri gibi olmayan pigmentli nedenle kapalı zaman eğrileri, kullanmak için değerlendirilmektedir. Biz kanser cells13 altın nanopartiküller kullanarak ön çalışma gerçekleştirdik. Bu testler nanopartiküller foto akustik dalgaları üretmek için gerekli optik soğurma sağlayabileceğini göstermiştir. Kalan teknik zorluk gibi parçacıklar kanser hücrelerini seçici eklemek.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234