Summary
Мы разработали потока цитометр использованием лазерной индуцированной ультразвук для выявления циркулирующих клеток меланомы, как ранний индикатор метастазов.
Abstract
Циркулирующих опухолевых клеток (ТХМ) те клетки, которые отделены от макроскопических опухоли и распространяются через кровь и лимфатическую системы, чтобы семя вторичные опухоли 1,2,3. ЦЛХ являются индикаторами метастазов и их обнаружение в образцах крови может быть использован для диагностики рака и контроля ответа пациента на терапию. С ЦЛХ редки, включающий около опухолевых клеток из миллиардов нормальных клеток крови в прогрессирующих больных раком, их обнаружения и подсчета является сложной задачей. Мы используем наличие пигмента в большинстве клеток меланомы генерировать фотоакустической или лазерной индуцированной ультразвуковых волн в пользовательских цитометр потока для выявления циркулирующих клеток меланомы (ОМЦ) 4,5. Этот процесс влечет за собой разделение всего образца крови с помощью центрифугирования и получения белого слоя клеток крови. При наличии в цельной крови, СМС будет отделять с белых клеток крови из-за одинаковой плотности. Эти клетки ресуспендировали вфосфатным буферным раствором (PBS) и внедрены в расходомера. Вместо того, чтобы непрерывный поток суспензии клеток крови, мы индуцированных двухфазного потока, чтобы захватить эти клетки для дальнейшего изучения. В двухфазных потоков, двух несмешивающихся жидкостей в микрофлюидных системы встречаются в форме перехода и переменного слизняков жидкого 6,7. PBS приостановлено белых клеток крови и воздуха слизняков форме мкл, которые последовательно облучении лазерным светом. Добавлением поверхностно-активных веществ в жидкую фазу обеспечивает равномерную образование водяной пробки, и пользователь может создавать различные размеры пули путем изменения расхода два этапа. Слизни воздуха и слизняков ФСБ с белой клетки крови не содержат поглотители свет и, следовательно, не производят фотоакустической волн. Тем не менее, слизняки белых кровяных клеток, которые содержат еще одно СМС поглощать лазерное излучение и производить высококачественные акустические волны частоты. Эти слизняков, которые генерируют фотоакустической волны поглощенного и собрали для цитохимических окрашивание на verification в ОМЦ.
Protocol
1. Подготовка Анализ крови
- Нарисуйте примерно 10 мл цельной крови от больного раком IV стадии на две 5 мл vacutainers.
- Центрифуги трубы в течение десяти минут при 3000 оборотов в минуту (RPM).
- Кровь будет разделиться на трех различных слоев: нижний слой состоит из эритроцитов, средний слой, называемый также пальто Баффи, содержит лейкоцитов и клеток меланомы, а верхний слой содержит плазму и тромбоциты. Удалить столько плазмы возможно без нарушения слоя кровяного сгустка.
- Место 250 мкл Histopaque 1077 в двух трубах 1 мл Wintrobe.
- Использование 9 "Пипетка Пастера, извлекать оставшиеся плазмы, весь слой кровяного сгустка, и даже верхний слой эритроцитов, убедившись, что для сбора <500 мкл.
- Место решения на вершине Histopaque слой и центрифуги Wintrobe трубы в 15 мл конические пробирки в течение 10 минут при 3000 оборотах в минуту.
- Кровь сноваотдельный, но на этот раз эритроциты будут разделены Histopaque, что позволяет легко добычи пальто Баффи. Использование 9 "Пипетка Пастера, чтобы получить весь слой кровяного сгустка и поместить его в трубку 2 мл Эппендорф.
- Приостановить слой кровяного сгустка в 1,5 мл PBS с 2% об. / Tween 20.
2. Строительство потока палаты
- Получить акрилового цилиндра 20 мм, внешний диаметр, 17 мм внутреннего диаметра и 8 мм в высоту. Просверлите три отверстия 5 мм диаметр через сторону цилиндра под углом 90 градусов друг от друга. Отрежьте три куска трубы полимера (1,6 мм внутреннего диаметра, 5 мм наружный диаметр), и поместить их в просверленные отверстия.
- Стретч парафильмом в нижней части акриловых кольцо, чтобы сделать водонепроницаемое уплотнение. Парафильмом формы мелкой миске с акриловым ринг и проведет акриламида решение, которое сформирует проточную камеру.
- Приостановить диаметром 1,6 мм провод через куска трубы, которые через дорогу отдруг с другом, чтобы убедиться, что провод только виден через середину кольца. Заполните третий кусок трубы с 1,6 мм Диаметр проволоки и положение трубки 1 мм от приостановлено провода. Эти провода предотвратить попадание акриламида труб. После акриламида затвердевает, провода будут извлечены, оставив цилиндрическую пути потока и место для размещения оптического волокна сосредоточен на пути потока.
- Добавьте 5 мл подготовленной акриламида [20 г акриламида (Sigma Aldrich), 0,7 г bisacrylamide (Sigma Aldrich), 100 мл дистиллированной воды] для небольшой стакан. Отмерьте 0,02 г персульфата аммония (Sigma) и добавить его в стакан. Смешать с мешалкой в течение 3 минут. Добавьте 20 мкл tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) в стакан. Быстро влить смесь в акриловых кольцом, заполняя до самого верха. Через несколько секунд, решение будет гель, делающий формы проточную камеру. Осторожно вытащите провода из, убедившись, что не нарушить акриламида гель. Поток камереBER готов к использованию.
3. Фотоакустическая флоуметрии настройки
- Акустически пару поливинилиденфторида пьезоэлектрического преобразователя акустическая (Panametrics) на проточную камеру с помощью ультразвука гель непосредственно над потоком путь.
- Использование байонетного Neill-Concelman (BNC) кабель, подключить датчик к входу широкополосного RITEC приемник-640A (ФНЧ: из, фильтр верхних частот: 1 МГц, вложили сопротивление: 50 Ом, усиление: 35 дБ). Подключите выход фильтра для осциллографа (Tektronix TDS 2024B). Для запуска осциллографа, фотодиод (Thorlabs) установлен возле датчика и подключен к осциллографу использованием BNC кабеля.
- Т-коннектор (мелкие детали) прилагается к одному из плеч проточную камеру. Два шприцевые насосы (Braintree Научно) связаны с другими отраслями разъем. Один шприц содержит воздух, в то время как другой будет содержать суспензию клеток подготовлен в части 1. Установить расход на100 мкл / мин.
- Извлечение небольших трубок проточную камеру, пока маленький карман воздуха формы и вставить 1 мм диаметр сердцевины оптического волокна с числовой апертурой 0,37 в этом слоте. Заполните карман с водой, чтобы уменьшить сигналов интерфейса и увеличения количества света лазера применяется к потоку пути. В связи с числовой апертуры оптического волокна и небольшое расстояние от потока пути, лазерное облучение будет только одна пуля образца в любой момент времени, гарантируя, что образец непосредственно перед лазерным же образца создания фотоакустической сигналов. Лазерная энергия должна быть примерно 28 мДж / см 2 с пятном размером 7 мм 2.
- Выключите обе шприцевые насосы далее. При двух несмешивающихся жидкостей достигает Т-образного перекрестка, они будут разделены на однородные слизняки и обтекания датчика.
- Радиация течет образца с наносекундного импульсного лазера для генерации волн в ФА клеток меланомы. Как меланин broadbи оптических поглотитель, видимые длины волны лазера могут быть использованы.
- Если появляется сигнал на экране осциллографа, когда пуля находится на вершине датчика, пули содержит меланомы, и должны быть отслежены с помощью системы до падения в коллекции флаконе.
4. Иммуноцитохимическая
- Возьмите захватили слизняков, чтобы цитоспина 4 Центрифуга (Thermo Scientific), с тем чтобы исправить их в стеклах. Место стеклах в Cytofunnels (Шандон EZ Одноместный Cytofunnel с Брауном фильтра карты Thermo Scientific) и загружать их в цитоспина 4 центрифуги. Положите 100 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (Sigma) в PBS в каждую воронку, а затем центрифуги в 600 оборотов в минуту в течение 3 минут, чтобы помочь захватили клетки придерживаться стеклах.
- После центрифугирования, добавить ячейки образцов Cytofunnels а затем центрифуги в 600 оборотов в минуту в течение 3 минут. Затем спрей слайды с этанолом основан фиксатором.
- Вымойте слайдов в PBS в течение 10 минут два раза.
- После инкубации, переливать слайды и инкубировать с первичным решением антител в течение 1 часа во влажной камере при комнатной температуре. Каждый слайд должен содержать 1% MART-1 антителами, поднятых в кролика, 1% CD-45 антител, поднятые в мыши, 10% сыворотки козьего, и 89% PBS.
- После инкубации, мыть слайдов в PBS в течение 10 минут три раза.
- Слайды затем инкубируют в средней решение антитела, которые флуорофор связан с антителами. Смесь, содержащая 0,05% козий анти-антител кролика, 0,05% козьего анти-мышиного антитела, 0,1% сыворотки козьего, и 99% PBS. Слайды инкубируют в темноте в течение 1 часа при комнатной температуре.
- После инкубации переливать слайды мыться в PBS в течение 5 минут три раза.
- Для окрашивания ядра, инкубировать клетки с 0,1 мкг / мл DAPI (Invitrogen) для1 минута. Затем перелить слайды и мыться в PBS.
- Горы покровное по ячейке образца с помощью 20 мкл на основе синтетических смол монтажа СМИ на слайд. Печать покровное прозрачным лаком ногтей, чтобы сохранить слайд. Теперь слайды готовы для включения в образ с флуоресцентным микроскопом.
5. Представитель Результаты:
Рисунок 1. Фотоакустической сигналов от лейкоцитов и клеток меланомы показаны здесь. Белые кровяные клетки, не имея присущей пигментацию, не производят фотоакустической волн и проявляется в виде плоской линии электронного шума (слева). Пигментных клеток меланомы производит надежные фотоакустической волны (справа).
Рисунок 2. Иммуноцитохимического После окрашивания, культивируемых клеток меланомы показать DAPI сигналов в блу.е. в то время как MART1 подсвечивается зеленым цветом.
Рисунок 3. Наложение изображений для DAPI и MART1, как показано на рисунке 2, CD45 как показатель лейкоцитов, эта цифра показывает, клетки меланомы среди нескольких белых кровяных клеток.
Discussion
Обнаружение ЦЛХ еще наукоемких поле с очень мало клинического применения в связи с трудной проблемой выделения редких опухолевых клеток. Многие другие методы, для которого определяется СТС обнаружения, в том числе RT-PCR, микрофлюидных захвата клетки, иммуномагнитный захвата, а также другие методы 8-12. Тем не менее, ФА обнаружение показывает ОМЦ обещание, как это метки, свободное и обеспечивает быстрое и точное средство для захвата маленький, легкий поглощающих частиц.
Протокол, описанный изолировать белых кровяных клеток имеет высокую эффективность, но низкое число красных кровяных клеток существует в образце. Эти румяна загрязняющих клетки также поглощают лазерное излучение, но в значительно снизился уровень. Для обеспечения красные кровяные клетки не вмешиваются в наши системы обнаружения меланомы, пять нормальных анализов пациента были введены через систему, и ни один дал сигнал, указывая, что красные кровяные клетки присутствуют при достаточно низких концентрацияхможно пренебречь.
Серия концентрации исследования были проведены с использованием культуры клеток меланомы и фотоакустической поток в системе оказалось чувствительным до 1 кл / мкл (неопубликованные данные). Эти исследования при переходе и в ближайшее время включают испытания на образцах раковых больных.
Это фотоакустической техника также оценивается для использования в непигментированной ТХМ, таких как рак молочной железы и рака предстательной железы путем присоединения экзогенных хромофоров. Мы провели предварительные работы с использованием наночастиц золота на рак cells13. Эти испытания показали, что наночастицы могут предоставить необходимые оптического поглощения для получения ФА волн. Остальные технические задачей является приложить таких частиц к раковым клеткам выборочно.
Disclosures
Джон А. Путник является основателем и президентом Viator Technologies Inc, компании, созданной для коммерциализации фотоакустической технологии для улучшения здоровья человека.
Acknowledgments
Мы признаем, поддержке Департамента биологической инженерии и Кристофер С. Бонд наук о жизни центра при университете штата Миссури. Мы признаем, грантовую поддержку из Миссури Life Sciences Совет по исследованиям 09-1034 и NIH R21CA139186-0. Мы также благодарим Бакалавриат Науки о живой Возможность Программа исследований в Университете Миссури, Университет Миссури Основные молекулярной цитологии и Университета Миссури инженерного колледжа за финансовую поддержку.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | Invitrogen | ABCD1234 |
References
- Pantel, K., Brakenhoff, R., Brandt, B. Detection clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8, 329-340 (2008).
- Pantel, K., Brakenhoff, R.
Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer. 4, 448-456 (2004). - Yu, M., Stott, S. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. The Journal of Cell Biology. 192, 373-373 (2011).
- Detection of circulating melanoma cells in human blood using photoacoustic flowmetry. Weight, R. M., Dale, P. S., Viator, J. Annual International Conference of the IEEE, 2009, , IEEE. 106-109 (1985).
- Weight, R. M., Dale, P. S., Lisle, A., Caldwell, C., Viator, J. A. Photoacoustic detection of metastatic melanoma cells in the human circulatory system. Opt. Lett. 31, 2998-3000 (2006).
- Gupta, A., Kumar, R. Effect of geometry on droplet formation in the squeezing regime in a microfluidic T-junction. Microfluidics and Nanofluidics. 8, 799-812 (2010).
- Mocellin, S., Hoon, D., Ambrosi, A., Nitti, D., Rossi, C. The prognostic value of circulating tumor cells in patients with melanoma: a systematic review and meta-analysis. Clinical Cancer Research. 12, 4605-4605 (2006).
- Cristofanilli, M., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Matera, J., Miller, M., Reuben, J., Doyle, G., Allard, W., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 351, 781-781 (2004).
- Cristofanilli, M., Hayes, D., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Reuben, J., Doyle, G., Matera, J., Allard, W., Miller, M. Circulating tumor cells: a novel prognostic factor for newly diagnosed metastatic breast cancer. Journal of Clinical Oncology. 23, 1420-1420 (2005).
- Ghossein, R., Scher, H., Gerald, W., Kelly, W., Curley, T., Amsterdam, A., Zhang, Z., Rosai, J. Detection of circulating tumor cells in patients with localized and metastatic prostatic carcinoma: clinical implications. Journal of Clinical Oncology. 13, 1195-1195 (1995).
- Loberg, R., Fridman, Y., Pienta, B., Keller, E., McCauley, L., Taichman, R., Pienta, K. Detection and isolation of circulating tumor cells in urologic cancers: a review. Neoplasia. 6, 302-302 (2004).
- Viator, J. A., Gupta, S. K., Goldschmidt, B. S., Bhattacharyya, K., Raghuraman, R., Shukla, R., Dale, P. S., Boote, E., Katti, K. Detection of gold nanoparticle enhanced prostate cancer cells using photoacoustic flowmetry with optical reflectance. J. Biomed. Nanotech. 6, 187-191 (2010).