Detecção e isolamento de células de melanoma circulantes usando Fluxometria Fotoacústica

Summary

Nós desenvolvemos um citômetro de fluxo, utilizando ultra-som para detectar a laser induzida circulando células de melanoma como um indicador precoce de doença metastática.

Abstract

Células tumorais circulantes (CTCs) são as células que se separaram de um tumor macroscópico e difundir através dos sistemas de sangue e da linfa aos tumores secundários de sementes ^1,2,3. CTCs são indicadores de doença metastática e sua detecção em amostras de sangue podem ser usados ​​para diagnosticar o câncer e monitorar a resposta do paciente à terapia. Desde CTCs são raros, compreendendo cerca de uma célula tumoral entre bilhões de células sanguíneas normais em pacientes com câncer avançado, a sua detecção e enumeração é uma tarefa difícil. Nós explorar a presença de pigmento na maioria das células do melanoma para gerar fotoacústica, ou laser induzida ondas ultra-sônicas em um citômetro de fluxo personalizado para a detecção de células de melanoma circulantes (CMCs) ^4,5. Este processo implica separar uma amostra de sangue total usando centrifugação e obter a camada de células brancas do sangue. Se presente no sangue total, CMCs vai separar com as células brancas do sangue, devido à densidade semelhante. Estas células são ressuspendidas emtampão fosfato (PBS) e introduzido o medidor de vazão. Ao invés de um fluxo contínuo de suspensão de células do sangue, que induziu duas fluxo da fase a fim de capturar essas células para posterior estudo. Em dois fluxo de fase, dois líquidos imiscíveis em um sistema microfluídicos se encontram em uma junção e forma alternada slugs de ^6,7 líquidos. PBS suspensão glóbulos brancos e lesmas ar microlitro forma que são seqüencialmente irradiado com luz laser. A adição de um surfactante para a fase líquida permite a formação slug uniforme e que o usuário pode criar diferentes lesmas porte, alterando as taxas de fluxo de duas fases. Lesmas do ar e lesmas de PBS com células brancas do sangue não contém absorvedores de luz e, portanto, não produzem ondas fotoacústica. No entanto, lesmas de células brancas do sangue que contêm mesmo CMCs única absorvem a luz laser e produzir ondas acústicas de alta freqüência. Essas lesmas que geram ondas fotoacústica são seqüestrados e recolhidos para a coloração citoquímica para verificção de CMCs.

Protocol

1. Preparação de amostras de sangue

1. Desenhe aproximadamente 10 mL de sangue total de um paciente de cancro Estágio IV em dois tubos sob vácuo 5 mL.
2. Centrifugar os tubos durante 10 minutos a 3.000 rotações por minuto (rpm).
3. A amostra de sangue será separado em três camadas diferentes: a camada inferior compreende os eritrócitos, a camada intermediária, também chamada de buffy coat, contém leucócitos e células de melanoma, ea camada superior contém plasma e plaquetas. Remover o plasma tanto quanto possível, sem perturbar o buffy coat.
4. ML lugar 250 de 1077 Histopaque em dois tubos de um Wintrobe mL.
5. Usando um 9 "Pasteur Pipeta, extraia o plasma restante, o revestimento buffy inteiro, e até mesmo a camada superior de eritrócitos, certificando-se de recolher <mL 500.
6. Coloque a solução em cima da camada de Histopaque e centrifugar os tubos Wintrobe em 15 mL tubos cônicos por 10 minutos a 3000 rpm.
7. O sangue será novamenteseparado, mas desta vez os eritrócitos serão separados pelo Histopaque, permitindo a fácil extração do buffy coat. Use um 9 "Pasteur Pipeta para obter o buffy coat todo e colocá-lo em um tubo eppendorf 2 ml.
8. Suspender a buffy coat em 1,5 mL de PBS com 2% v / v de Tween 20.

2. Construção câmara de fluxo

1. Obtenção de um cilindro de acrílico, 20 mm de diâmetro externo, 17 mm de diâmetro interno, e 8 mm de altura. Perfurar três buracos de 5 mm de diâmetro através do lado do cilindro em ângulos de 90 graus um do outro. Corte três pedaços de tubo de polímero (1,6 mm de diâmetro interno, 5 mm de diâmetro externo), e colocá-los nos orifícios perfurados.
2. Estiramento Parafilm na parte inferior do anel de acrílico para fazer um selo à prova d'água. O parafilme forma uma bacia rasa com o anel de acrílico e irá realizar a solução de acrilamida que formam uma câmara de fluxo.
3. Suspender um fio de 1,6 mm de diâmetro através dos pedaços de tubos que estão em frenteo outro, certificando-se que o fio por si só é visível através do meio do ringue. Preencher a terceira peça de tubo com um fio de diâmetro 1,6 mm e posição do tubo 1 mm de distância do fio suspenso. Estes fios evitar acrilamida de entrar na tubulação. Após a acrilamida se solidifica, os fios serão extraídos, deixando um caminho de fluxo cilíndrico e um lugar para a posição de uma fibra óptica se concentra no caminho de fluxo.
4. Adicionar 5 mL de acrilamida preparado [20 acrilamida g (Sigma Aldrich), 0,7 g bisacrylamide (Sigma Aldrich), 100 mL de água destilada] para um copo pequeno. Medir 0,02 g de persulfato de amônio (Sigma) e adicioná-lo no copo. Misture com uma barra de agitação por 3 minutos. Adicionar 20 mL tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) para o copo. Rapidamente despeje a mistura no anel de acrílico, enchendo até o topo. Após alguns segundos, a solução de gel, fazendo um molde de câmara de fluxo. Com cuidado, puxe os fios para fora, tomando cuidado para não perturbar o gel de acrilamida. O fluxo de chamber agora está pronto para usar.

3. Fluxometria fotoacústica set-up

1. Acusticamente um par de polivinilideno de fluoreto transdutor acústico piezoelétrico (Panametrics) para uma câmara de fluxo, utilizando gel de ultra-som diretamente acima do caminho de fluxo.
2. Usando uma baioneta Neill-Concelman (BNC) cabo, conectar o transdutor para a entrada de um receptor de banda larga RITEC-640A (filtro passa-baixa: out, highpass filtro: 1 MHz, Impedância de entrada: 50 Ohms, amplificação: 35 dB). Conecte a saída do filtro ao osciloscópio (Tektronix TDS 2024B). Para acionar o osciloscópio, um fotodíodo (Thorlabs), é criada perto do transdutor e é conectado ao osciloscópio através de um cabo BNC.
3. A t-connector (Small Parts) é ligado a um braço da câmara de fluxo. Duas bombas de seringa (Braintree Científica) estão ligados a outros ramos do conector. Uma seringa contém ar, enquanto o outro irá conter a suspensão de células preparadas na parte 1. Definir o fluxo para100 L / minuto.
4. Extraia o tubo pequeno da câmara de fluxo até que uma pequena bolsa de ar de formas, e inserir um 1 milímetro de diâmetro do núcleo de fibra óptica com uma abertura de 0,37 numérica nesse slot. Encha o bolso com água para reduzir os sinais de interface e aumentar a quantidade de luz laser aplicada ao caminho de fluxo. Devido à abertura numérica da fibra óptica e curta distância para o caminho do fluxo, o laser só vai irradiar um slug de amostra em um dado momento, garantindo que a amostra diretamente na frente do laser é a mesma amostra criando sinais fotoacústica. A energia do laser deve ser cerca de 28 mJ / cm ^2, com um tamanho de ponto, de 7 mm ^2.
5. Vire ambas as bombas de seringa por diante. Quando os dois fluidos imiscíveis chegar ao entroncamento que vai ser particionado em lesmas homogênea e passar ao lado do transdutor.
6. Irradiar a amostra flui com um nanossegundo pulsada a laser para gerar ondas fotoacústica nas células de melanoma. Como a melanina é uma broadbe ópticas de absorção, qualquer comprimento de onda do laser visível pode ser usado.
7. Se um sinal aparece no osciloscópio quando uma lesma está no topo do transdutor, a lesma contém melanoma, e deve ser monitorado através do sistema até cair em um frasco de coleta.

4. Imunocitoquímica

1. Pegue as lesmas capturado a um 4 Cytospin Centrífuga (Thermo Scientific), a fim de corrigi-los a lâminas de vidro. Colocar as lâminas de vidro em Cytofunnels (Shandon Cytofunnel EZ único com Brown Filtro Cartão Thermo Scientific) e colocá-los na 4 Cytospin centrífuga. Coloque 100 mL de 1% albumina bovina (Sigma) em PBS em cada funil e, em seguida, centrifugar a 600 rpm por 3 minutos para ajudar as células capturadas ater ao lâminas de vidro.
2. Após a centrifugação, adicionar as amostras de célula para a Cytofunnels e centrifugar a 600 rpm por 3 minutos. Em seguida, pulverizar a slides com um fixador de etanol à base.
3. Lavar as lâminas em PBS por 10 minutos duas vezes.
4. Após a incubação, decanta os slides e incube com a solução de anticorpo primário por 1 hora em câmara úmida à temperatura ambiente. Cada slide deve conter 1% MART-1 anticorpos produzidos em coelho, um CD-45% de anticorpos criados em mouse, soro de cabra 10%, e PBS 89%.
5. Após a incubação, lavar as lâminas em PBS por 10 minutos três vezes.
6. As lâminas são incubadas em uma solução de anticorpo secundário, que tem fluoróforo ligado aos anticorpos. A mistura contém 0,05% de cabra anti-coelho de anticorpos, 0,05% de anticorpos de cabra anti-rato, soro de cabra 0,1% e PBS 99%. As lâminas são incubadas no escuro por uma hora em temperatura ambiente.
7. Após a incubação, decanta as lâminas de lavagem em PBS por 5 minutos, três vezes.
8. A mancha de um núcleo, incubar as células com 0,1 g / mL de DAPI (Invitrogen) para1 minuto. Decantar o slides e lavar em PBS.
9. Monte uma lamela sobre a amostra de células usando 20 mL de uma mídia baseada em resina de montagem por slide. Selar a lamela com unhas polonês claro para preservar o slide. Agora os slides estão prontos para ser fotografada com um microscópio de fluorescência.

5. Resultados representativos:

Figura 1. As formas de onda fotoacústica partir de células brancas do sangue e células de melanoma são mostrados aqui. As células brancas do sangue, não tendo nenhuma pigmentação inerente, não produzem ondas de fotoacústica e se manifestar como uma linha reta de ruídos eletrônicos (à esquerda). As células de melanoma pigmentada produz uma onda robusta fotoacústica (direita).

Figura 2. Após a coloração imunocitoquímica, células de melanoma cultivadas mostram sinais de DAPI em blue enquanto MART1 é destaque em verde.

Figura 3. Sobrepondo imagens para DAPI e MART1, como na Figura 2, com CD45 como um indicador de leucócitos, esta figura mostra células de melanoma entre várias células brancas do sangue.

Discussion

Detecção de CTCs ainda é um campo de pesquisa intensiva com muito poucas aplicações clínicas devido ao problema difícil de isolar as células do tumor raro. Muitas outras técnicas estão sendo avaliadas para CTC detecção, incluindo RT-PCR, captura célula microfluídica, captura imunomagnética, e outros métodos ^8-12. No entanto, a detecção fotoacústica da mostra CMCs promessa como é rótulo livre e fornece um meio rápido e preciso para capturar pequenas partículas de luz absorvente.

O protocolo descrito para isolar as células brancas do sangue é altamente eficiente, mas um baixo número de glóbulos vermelhos existem na amostra. Estas células rouge contaminando também absorvem a luz laser, mas a um nível bastante reduzido. Para garantir os glóbulos vermelhos não interferem com o nosso sistema de detecção de melanoma, cinco amostras de pacientes saudáveis ​​foram introduzidas através do sistema e não deu um sinal, indicando que as células vermelhas do sangue estão presentes em baixas concentrações o suficiente paraser desconsiderada.

Uma série de estudos de concentração foram realizados com células de melanoma cultivadas eo sistema de fluxo fotoacústica mostrou sensível até 1 célula / mL (dados não publicados). Estes estudos estão em curso e em breve incluirá ensaios utilizando amostras de doentes de câncer.

Esta técnica fotoacústica também está sendo avaliado para uso em não-pigmentadas CTCs, como de mama e câncer de próstata, anexando cromóforos exógenos. Temos realizado um trabalho preliminar usando nanopartículas de ouro sobre o câncer cells13. Estes testes mostraram que as nanopartículas podem proporcionar a absorção óptica necessária para gerar ondas fotoacústica. O desafio técnico é demais para anexar tais partículas de células de câncer seletivamente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234