Vi har utvecklat en flödescytometer med laser inducerad ultraljud för att upptäcka cirkulerande melanom celler som en tidig indikator på metastaserad sjukdom.
Cirkulerande tumörceller (CTCS) är de celler som har separerade från en makroskopisk tumör och sprids genom blod och lymfa system till utsäde sekundära tumörer 1,2,3. CTCS är indikatorer på metastaserad sjukdom och deras upptäckt i blodprov kan användas för att diagnostisera cancer och övervaka en patients svar på behandlingen. Eftersom CTCS är sällsynta, omfattar ca en tumör cell bland miljarder av normala blodkroppar i framskriden cancer patienter, deras upptäckt och kvantifiering är en svår uppgift. Vi utnyttjar närvaron av pigment i de flesta melanom celler för att generera photoacoustic, eller laser inducerad ultraljudsvågor i en anpassad flödescytometer för detektion av cirkulerande melanom celler (CMCs) 4,5. Denna process innebär att separera ett helblodsprov med centrifugering och få det vita lagret blodkroppar. Om det finns i blod, kommer CMCs separera med de vita blodkroppar på grund av liknande densitet. Dessa celler är suspenderade ifosfatbuffrad saltlösning (PBS) och förs in flödesmätaren. I stället för ett kontinuerligt flöde av blod cellsuspensionen framkallade vi två fas flöde för att fånga dessa celler för vidare studier. I två fas flöde, två icke blandbara vätskor i en mikroflödessystem träffas i en korsning och bildar alternerande sniglar av flytande 6,7. PBS svävande vita blodkroppar och luft bildar sniglar mikroliter som sekventiellt bestrålas med laserljus. Tillägget av ett ytaktivt till vätskefasen låter enhetlig proppbildning och användaren kan skapa olika stora sniglar genom att ändra flöden de två faserna. Sniglar av luft och sniglar i PBS med vita blodkroppar innehåller inga ljus absorbenter och därmed inte ger photoacoustic vågor. Men sniglar av vita blodkroppar som innehåller ens enda CMCs absorberar laserljuset och producera höga vågor frekvens akustiska. Dessa sniglar som genererar photoacoustic vågor är binds och samlas in för cytochemical färgning för verificring av CMCs.
Upptäcka CTCS är fortfarande ett forskningsintensivt område med mycket få kliniska tillämpningar på grund av det svåra problemet att isolera den sällsynta tumörceller. Många andra tekniker håller på att utvärderas för CTC detektering, inklusive RT-PCR, mikroflödessystem cell fånga, immunomagnetic fånga, och andra metoder 8-12. Men photoacoustic upptäckt av CMCs visar löfte som det är etikett gratis och ger en snabb och korrekt sätt för att fånga små, ljusabsorberande partiklar.
Protokollet beskrivs att isolera vita blodkroppar är mycket effektiv, men ändå ett lågt antal röda blodkroppar finns i provet. Dessa rouge förorena celler absorberar också laserljus, men på en kraftigt minskad nivå. För att säkerställa de röda blodkropparna inte stör vårt melanom detektionssystem har fem friska patientprover infördes genom systemet och ingen gav en signal som indikerar att röda blodkroppar är närvarande vid tillräckligt låg koncentrationerlämnas utan avseende.
En rad koncentration studier har genomförts med hjälp av odlade melanom celler och photoacoustic flödet systemet har visat känslig ner till en cell / mikroliter (opublicerade data). Dessa studier är på väg och kommer snart att inkludera studier med prover cancerpatient.
Detta photoacoustic teknik utvärderas också för användning i icke-pigmenterade CTCS, såsom bröst-och prostatacancer genom att lägga exogena kromoforer. Vi har utfört förberedande arbete med hjälp av guld nanopartiklar om cancer cells13. Dessa tester har visat att nanopartiklar kan ge den nödvändiga optisk absorption för att generera photoacoustic vågor. De återstående tekniska utmaningen är att fästa sådana partiklar till cancerceller selektivt.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner stöd av Institutionen för bioteknik och Christopher S. Bond-Life Sciences Center vid University of Missouri. Vi erkänner bevilja stöd från Missouri Life Sciences Research Board 09-1034 och NIH R21CA139186-0. Vi tackar också livsvetenskaper grundutbildningen Forskning Opportunity vid University of Missouri, University of Missouri molekylär Cytologi Core, och University of Missouri College of Engineering för ekonomiskt stöd.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM | Invitrogen | ABCD1234 |