Summary
一个方法是使用固态纳米孔监测到无机表面蛋白质的非特异性吸附描述。该方法采用电阻脉冲的原则，允许实时和单分子水平探讨吸附。因为单一的蛋白质吸附过程是远离平衡，我们建议平行合成纳米孔阵列的就业，使表观一级反应速率常数蛋白质吸附定量测定以及和Langmuir吸附常数。
Abstract
固态纳米孔已被用来执行在单分子水平测量，以考察当地的结构和灵活性 1-6核酸， 蛋白质 7开展，8种不同的配体结合的亲和力。通过这些孔洞耦合9-12电阻脉冲技术，这样的测量，可以做各种各样的条件下，没有标签 3 。电阻脉冲技术，离子的盐溶液中引入纳米孔的两侧。因此，离子驱动从一个会议厅一侧的其他应用的跨膜电位，造成在一个稳定的电流。分析物的纳米孔的分割，导致在当前的定义良好的偏转，它可以分析提取单分子信息。使用这种技术，纳米孔壁的单个蛋白质的吸附作用，可以广泛的监视下条件13。蛋白质吸附的重要性越来越大，因为微流体器件尺寸的缩小，这些系统与单一蛋白质的相互作用成为一个令人关注的问题。这一协议描述为氮化物薄膜，它可以很容易地扩展到其他薄膜进行纳米孔钻，或功能化氮化物表面蛋白结合的快速检测。下一个广泛的解决方案和变性条件下，可以探索多种蛋白质。此外，该协议可用于探索使用纳米孔光谱的基本问题。
Protocol
1。氮化硅膜固态纳米孔的制造
- 把费Tecnai F20的S /透射电镜一个200千伏的加速电压。如果使用不同的S /透射电子显微镜，加速电压应大于或等于200千伏9
- TEM样品架装入一个20纳米厚的SPI氮化硅窗口电网和清洁除去持有人的任何污染物与氧气30秒的等离子体。
- 装入的S / TEM样品，并允许为真空抽空。一旦S /透射电镜抽空真空，发现在明场TEM模式通过寻找光明广场上的Ronchigram的氮化硅窗口。确保透射电镜正确对齐，然后调整和重点样本。
- 切换成干模式的S / TEM。使用HAADF（或同等学历）探测器的图像样本，并确保它是正确对齐。
- 的单色设置为较低的值。一个单色低的值允许为一个更高的CURRENT为钻探提供的电子。 S /透射电镜如果没有一个单色，忽略这一步。
- 选择适当的位置钻纳米孔大小。与此对应的电子探针的直径。 3纳米探头为钻孔直径为5 nm的毛孔。一个较大的探头（5 nm）的钻更快速地创建一个较大的孔隙。一个较小的探头（1纳米）将需要更长的时间进行钻孔，创建一个较小的孔隙。
- 调整干线路走向，如果必要的话。
- 焦点氮化物膜，并把它放大的x1.3M。微调焦应通过监测Ronchigram。
- 如果有任何运动的样品，然后等待样品稳定。这可能需要长达一个小时。而等待，以免破坏氮化物空白的电子束。
- 电子探针和样品开始钻探。
- 定期检查与HAADF探测器扫描样品，既要确保纳米孔是被DRIlled（它看起来像一个暗斑），并检查有没有样品的运动。如果样品略有漂移，调整电子探针在纳米孔的位置。
- 观看Ronchigram确定何时已形成的孔隙。当焦点，氮化物膜有一个闪闪发光的外观。这会消失的纳米孔形式时。把重点Ronchigram略有允许一看菲涅尔纳米孔的边缘。
- 以纳米孔与HAADF形象。
- 做一个纳米孔图像的强度分布。纳米孔的直径可估计的剖面上最黑暗的地区。
- 扩大纳米孔可通过移动电子探针沿孔隙边缘。
- 一旦所需的直径是纳米孔，放入TEM模式的S / TEM。
- 其标准的制定和图像使用明场透射电子显微镜确认大小的纳米孔带来的单色
2。润湿的固态纳米孔
- 德气体的去离子水，含有氯化钾，1米10 mM磷酸钾，pH值7.4。这可以通过在真空状态下的解决方案，并放置在20分钟洗澡sonicator。
- 纳米孔含氮化硅芯片放入10毫升耐热烧杯。请注意不要打破氮化窗口，因为它是非常微妙的。烧杯放在一个烤盘在通风柜设置为100 ° C。
- 清洁食人鱼纳米孔的芯片解决方案，使用非常谨慎。首先加入3毫升硫酸的容器，使用的玻璃吸管。接下来，仔细加1 ml双氧水，硫酸，使食人鱼解决方案14。请采取一切预防措施。
- 允许的纳米孔的芯片，在食人鱼溶液浸泡10分钟。
- 从烧杯中使用的玻璃吸管取出食人鱼解决方案。它放到一个适当的存储插座。
- 连接LL与瓦斯的使用干净的玻璃吸管，去离子水的烧杯。空烧杯的水和重复至少5次。
- 纳米孔的芯片，并用干净的镊子取出干轻吸
- 随即，密封进入会议厅（图2A，2B）纳米孔的芯片 。O形圈或硅酮密封胶，该芯片可在会议厅内担保。
- 填写KCl溶液室
- 银/氯化银电极连接到室（图2b）。电极可浸泡在漂白隔夜银线。
- 适用于整个电极跨膜电位和监测使用在电压钳模式轴突200B膜片钳放大器的电流响应。
- 构造一个从测量的I / V（电流 - 电压）曲线。 I / V曲线高度线性的，当使用1米氯化钾（图3）。纳米孔电导应与它的直径。如果纳米孔不显示线性I / V曲线，电导过低，或不太稳定的纳米孔的开放电流（图4a），这意味着纳米孔是不正确的润湿和食人鱼洗应反复。
3。监控蛋白质吸附
- 这是非常重要的，执行与控制的单纳米孔膜或平行的纳米孔阵列（见下文），监察目前缺乏蛋白质样品与缓冲条件实验。我们建议以下两个步骤：（一）使用高纯度级缓冲（纯度> 99.9％;色谱级别），及（ii）使用一个缓冲区，其互动的固态纳米孔不产生单通道事件。此外，我们建议获得高纯度的蛋白质样品，使用标准的蛋白质化学程序。蛋白质样品的纯度应检查十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDS - PAGE）凝胶电泳分析和高分辨率的马SS法15。
- 添加到接地浴室研究的蛋白质纯化样品。允许样品弥漫整个洗澡的时间。典型的蛋白质，可测浓度纳米几十μm范围7,15-21。
- 套用一个跨膜电位偏压极性相反的被研究的蛋白质的总负责。例如，BSA在pH 7.4的一个有效的净负电荷，因此应适用于一个正电压偏置。外加电压相反电荷的纳米孔内部和蛋白质内创建电位梯度将被相反的力量驱动。只有驱动的蛋白质纳米孔的电压极性将建立可测量的信号。
- 一个应用潜力为200 mV的幅度应该足够大，观察大多数蛋白质分析物。事件将出现从基线（图4b）的瞬态电流挠度 。如果没有信号，提高蛋白的浓度，在会议厅内。更高的电压，提高信噪比。氮化物纳米孔可以承受几伏。
- 蛋白质吸附在纳米孔（图4c）的基准电流长寿命的变化会出现 。
4。功能化的纳米孔的可能性
功能团体申请氮化硅22,23存在的几种方法。大多数的氮化物薄膜有一个在外面，暴露在臭氧的一层薄氧化膜可以创建一个附加的氧化层，如果有必要的。可以使用不同的有机硅烷自组装到这样的层次。特别感兴趣的是氨基硅烷，自我组装并可以进一步修改（即，羧酸和醛类），允许检查范围的有机表面。在纳米孔已洗与食人鱼在chambe担保R，胺可以直接加入0.5 M的TBACl（四丁基）和用作溶剂的无水甲醇（甲醇）与支持电解质室洗澡。 400 mV的电压偏置和测量电流下降 23的应用可以监测单分子膜的形成。
5。表观一级反应速率常数的测定和Langmuir吸附常数使用并行纳米孔阵列
5.1表观一级反应吸附和解吸的速率常数
我们强调积极的一面，这种方法是在单分子水平上观察个别吸附能力。到无机表面蛋白质的吸附单分子的测量，可以按比例增加由用人固态纳米孔平行阵列。并行阵列的孔洞是必要的，因为许多毛孔检测需要得到可靠的统计第为此，使用了纳米孔阵列将允许个别吸附的监测以及测量多个事件作进一步的分析。在样品上钻多个孔，只需通过上述协议，可能会形成氮化硅纳米孔阵列。每个纳米孔应大小相似。应有足够的6x6或7X7纳米孔阵列。除了在会议厅内的蛋白质分析物后，电流会以指数方式衰减与下面的表达式：
I T =∞ - （我∞ -我0）EXP（- K“T）
在这里，I T，表示当前处于试验时间 t， 我 0是原来的电流通过纳米孔阵列。 我 ∞表示饱和程度的电流（即无穷大）。K'是明显的一阶反应速率不变，这可以从日决定发送合适的实验曲线。更大K'可以理解为一个更快的吸附率。比我 ∞/ I 0，也称为归饱和电流，是一个无量纲数0和1之间。此参数是衡量吸附的蛋白质分析物的占用。因此，每个不同的实验条件下，应与两个特定的输出参数 我 ∞/ 我 0和k' 。
应该指出的是明显的一阶吸附速率常数和规范化的电流是由蛋白质所花的孔洞内的有效时间的影响。这一次是依赖于散装水相中的蛋白质 24分析物浓度。因此，需要根据由蛋白质所花的有效时间内的纳米孔内部实施额外的校正这些数字。我们建议测量频率的FAST（易位）事件和乘以平均停留时间等事件。这将使单位时间内的蛋白质在纳米孔的内部花的平均时间。
解吸速率常数可确定使用了纳米孔以及并行阵列。只要目前的水平达到饱和（∞），电压应颠倒过来，所以没有更多的蛋白质被困入孔洞。更改记录的电流走向更大的价值将伴随着个别蛋白的解吸。从目前的水平上升速率常数，然后将提取。
5.2 Langmuir吸附常数
到孔洞的无机表面的蛋白质分析物的吸收是依赖于在水相中的蛋白浓度。这种现象已经观察到，在单分子水平 13 。如果θ代表的正常化饱和电流（ 我 ∞/ 我 0），然后是一个典型的Langmuir等温方程由下式：
其中 C是在水相中的蛋白浓度。α是Langmuir吸附常数。吸附结合能增加，温度下降，这不断增加。 θ的数据点的集合将采用并行阵列在各种蛋白质在水相中的浓度进行测量。分析数据应与其他技术相结合，以验证拟合Langmuir吸附常数的大小。此外，全面的原子分子动力学模拟25,26可能也被用于帮助所获得的实验数据的解释。
题目是“> 6代表性的结果。固态纳米孔的典型结果将会如下。开放孔隙当前应高度稳定， 如图所示。 4A。纳米孔的I / V特性，应高度1米氯化钾，磷酸钾，pH值7.4， 如图所示的线性 。 2。 I / V曲线的线性拟合的斜率将提供单一的纳米孔电导。电导有直接的关系，纳米孔直径应符合公式： 
， 其中 G是电导的纳米孔，D是其直径，l是其长度，σ是导电性的解决方案在会议厅内 14 。这个值应该匹配到30％以内。如果实在是太小，你的毛孔很可能不湿。此外蛋白质，快速的事件应该随之而来， 如图所示。 4B。普罗特EIN吸附是一个长期存在的电流图显示下降。 4C。一些蛋白质是高度不稳定，并进行内部孔隙内的结构转型。在这种情况下，长寿命的压降将伴随着快速波动。
图1。固态纳米孔采用一个Tecnai F20的S / TEM。在STEM模式下钻一个直径为20 nm的孔。图像拍摄于明场TEM模式。氮化物是30纳米厚。
图2。商会用于住房电阻脉冲测量一个单一的固态纳米孔A）商会和自由站立氮化窗口（TEM网格）的硅芯片。纳米孔钻成氮化物，装载前。红色O形圈，形成一个良好的小号EAL有关的芯片，它分隔两个浴场离子溶液。二）安置方案浴缸和电极与纳米孔分示意图。
图3典型的I / V不同直径的固态纳米孔的痕迹 。单通道电气痕迹1米氯化钾，20毫米的Tris，pH值8.5 。 30 nm厚的氮化硅纳米孔钻。注意氮化物的厚度会影响单一的纳米孔电导。
图4。测量单通道电流的痕迹和蛋白质吸附检测A）的单通道电气跟踪显示当前打开一个直径为10纳米的纳米孔。二）当前挠度代表分区间，牛血清白蛋白（BSA）IOR的纳米孔。 c）对BSA吸附的表面氮化。从1米氯化钾，10 mM磷酸钾，pH值7.4纳米孔的所有痕迹。应用的跨膜电位为40 mV和BSA是添加浓度在120 nm的接地室洗澡。
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Discussion
自发到固态表面27-29上的蛋白质吸附在一些领域，如生物芯片的应用和设计一个新的功能混合生物材料类，是从根本上重要的。以往的研究表明，吸附到固体表面的蛋白质不显示横向调动或显著解吸率，因此蛋白质的吸附通常被认为是一个不可逆转的和非特异性的过程30-32。到固态表面的蛋白质吸附被认为是由于多种因素， 包括 13在固-液界面的蛋白质和活性基团的侧链之间的静电和疏水力量。
蛋白质吸附的过程中一直探索的方法，如石英晶体微天平28,29，电子显微镜 ，33,34椭偏仪， 荧光标记35，36和扁平疣ř极化干涉（PPI）37相反，这种单纳米孔和纳米孔阵列的方法依赖于单一的蛋白质分析物和纳米孔内部之间的相互作用所产生的探测单通道电流的变化。
在最关键的一步，取得积极的成果，是适当的润湿的纳米孔内部。孔隙特征不符合结果一节中所讨论的规格，可用于几个故障排除方法。没有任何蛋白质在溶液中发生的瞬态电流封锁可能表明，该室被污染。聚四氟乙烯商会可洗与食人鱼。 PDMS的商会应该从每个实验的清洁模具新鲜。比预期的电导或非线性的I / V特性小孔洞，可能表明润湿是不成功的。高电压（〜5V）的一个简单的应用程序可能提高的纳米孔的电气特性。否则，纳米孔应与食人鱼溶液冲洗一遍。即使在最好的情况下，一些孔洞不湿正确。湿纳米孔的能力取决于其尺寸。较薄的氮化物纳米孔和直径较大的孔洞比较厚的氮化物纳米孔或更小直径的孔洞，更容易湿。 20纳米厚的纳米孔半径为5 nm的成功率约为70％后，第一次洗涤。应谨慎选择一个您的分析物的纳米孔大小，因为孔洞必须大到足以容纳蛋白质。
这里讨论该协议只适用于吸附氮化硅表面。其他的表面，如氧化硅或氧化铝23，也可能是钻了使用这种技术，但接受这种技术的薄膜的数量是有限的，可以制造让他们自由站立，薄，孔。为了克服这个问题，CHemical涂层的纳米孔，可用于 23,38-40 。另一种折衷的单纳米孔技术是，它只能在同一时间看一个分子。为了克服这种局限性，我们提供了一个使用固态纳米孔41的并行阵列的替代。纳米孔阵列的电流测量提供了一个机会获得宏观动力学参数，如吸收和解吸的表观一级反应速率常数，的。此外，这种方法将允许Langmuir吸附常数的测定。该技术的一个直接的限制是无法收集在平坦宽阔的表面的信息。测量探头制造的固态纳米孔内部的密闭空间内蛋白质的吸附。在许多情况下，这是很具挑战性，以获得精确的几何形状和纳米孔的内表面上的信息。在过去，蛋白质的吸附进行了广泛的研究石英晶体微量天平28,29 D。到晶体表面的蛋白质吸附是伴随着体微天平的振荡运动施加阻尼，产生共振频率下降。由于蛋白质吸附的总耦合大规模的改建诱导的石英晶体微天平的频移。总的吸附蛋白质量呈线性关系的频移。这是这种技术，从而间接探测器上的一个定义良好的平坦表面的蛋白质吸附的基本原则。相比之下，使用纳米孔阵列采用的电阻脉冲技术，是密切类似库尔特计数器的方法42。同样，纳米孔技术可以缩小到纳米孔膜的数量有限，所以个人的吸附可实时观看。相比之下石英晶体微天平，纳米孔测量无法评估大规模的吸附过程平坦的表面，其中附加的事件可能会发生（即横向扩散，吸附蛋白质），从而产生在Langmuir吸附等温线的改建。当然，这是可取的，用于蛋白质吸附这些方法应相互结合使用，因为它们探头只有一些吸附过程的各个方面。例如，Brewer和他的同事采用石英晶体微天平和ζ电位技术的组合显示，黄金纳米粒子和金表面上BSA的约束力通过静电的机制发生。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
作者想约翰Grazul（康奈尔大学），安德烈Marziali（在温哥华不列颠哥伦比亚大学）和外袍，科萨文森特（渥太华大学），以感谢他们的意见。这项工作是由美国国家科学基金会（DMR - 0706517和DMR - 1006332）和国立卫生研究院（R01 GM088403）资助部分经费。纳米孔钻在康奈尔大学材料研究中心（CCMR）从国家科学基金会支持的电子显微镜机制 - 材料研究科学和工程中心（MRSEC）程序（DMR 0520404）。氮化硅膜的制备是在康奈尔大学的纳米基金，国家纳米技术基础设施网络的成员，这是由国家科学基金会（格兰特ECS - 0335765）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tecnai F20 S/TEM | FEI | S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source. | |
| 20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM | SPI Supplies | 4163SN-BA | |
| Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| silicone O-rings | McMaster-Carr | 003 S70 | Alternatively use PDMS |
| silver wire | Sigma-Aldrich | 348759 | For electrodes |
| SPC Technology, D sub contact, pin | Newark Inc | 9K4978 | For electrodes |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber. | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | KWIK-CAST | Fast acting silicone sealant |
| hot plate | Fisher Scientific | ||
| Faraday cage |
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