Summary
Een methode van het gebruik van solid-state nanoporiën om de niet-specifieke adsorptie van eiwitten te controleren op een anorganisch oppervlak is beschreven. De methode maakt gebruik van de resistieve-puls principe, waardoor de adsorptie aan gezocht worden in real-time en op de single-molecule-niveau. Omdat het proces van enkel eiwit-adsorptie wordt ver van evenwicht, stellen wij de werkgelegenheid van parallelle arrays van synthetische nanoporiën, waardoor voor de kwantitatieve bepaling van de schijnbare eerste orde reactie snelheidsconstante van eiwitadsorptie evenals en de Langmuir adsorptie constant.
Abstract
Solid-state nanoporiën zijn gebruikt om metingen uit te voeren op de single-molecule niveau naar het lokale structuur en flexibiliteit van nucleïnezuren 1-6, het ontvouwen van eiwitten 7, en de bindingsaffiniteit van verschillende liganden acht te onderzoeken. Door het koppelen van deze nanoporiën om de resistieve-pulstechniek 9-12, kan dergelijke metingen worden gedaan onder een breed scala van omstandigheden en zonder de noodzaak voor etikettering 3. In de resistieve-pulse-techniek, is een ionisch zout-oplossing geïntroduceerd op beide zijden van de nanogaatje. Daarom zijn ionen verdreven uit de ene kant van de kamer naar de andere door een toegepaste transmembraan potentieel, wat resulteert in een constante stroom. Het partitioneren van een analyt in de nanogaatje veroorzaakt een goed gedefinieerde doorbuiging in de huidige, die kan worden geanalyseerd om single-molecule informatie eruit te halen. Met behulp van deze techniek kan de adsorptie van enkele eiwitten aan de nanogaatje muren worden gecontroleerd onder een breed scala aanvoorwaarden 13. Eiwit-adsorptie wordt steeds belangrijker, want als microfluïdische apparaten krimpen in omvang, de interactie van deze systemen met enkele eiwitten wordt een punt van zorg. Dit protocol beschrijft een snelle test voor eiwit binding aan nitride films, die gemakkelijk kan worden uitgebreid tot andere dunne films vatbaar voor nanogaatje boren, of om gefunctionaliseerde oppervlakken nitride. Een verscheidenheid van eiwitten kunnen worden bestudeerd onder een breed scala aan oplossingen en denaturerende omstandigheden. Bovendien kan dit protocol worden gebruikt om meer fundamentele problemen met behulp van spectroscopie nanogaatje te verkennen.
Protocol
1. Vervaardiging van solid-state nanoporiën in silicium nitride membranen
- Breng de FEI Tecnai F20 S / TEM tot een versnelling spanning van 200 kV. Bij gebruik van een ander S / TEM, moet de versnelling spanning groter dan of gelijk aan 200 kV 9
- Laad een 20 nm dikke SPI siliciumnitride venster rooster in de TEM monster houder en schoon met zuurstof plasma gedurende 30 seconden om alle verontreinigingen te verwijderen uit de houder.
- Laad het monster in de S / TEM en zorgen voor de vacuüm pomp naar beneden. Zodra de S / TEM heeft gepompt tot vacuüm, vinden de nitride raam in bright-field TEM-modus door te zoeken naar een heldere plein aan de Ronchigram. Zorg ervoor dat de TEM goed is uitgelijnd, maak er een nette en focus van het monster.
- Schakel de S / TEM in de STEM-modus. Gebruik de HAADF (of equivalent) detector om het imago van de monster en zorg ervoor dat het goed is uitgelijnd.
- Stel de Monochromator op een lage waarde. Een lagere waarde van de Monochromator zorgt voor een hogere valutat van elektronen beschikbaar zijn voor het boren. Als het S / TEM heeft geen Monochromator, deze stap overslaan.
- Selecteer een geschikte plek formaat voor het boren van de nanogaatje. Dit komt overeen met de diameter van de elektronen probe. Een 3 nm sonde werkt goed voor het boren van 5 nm diameter poriën. Een grotere sonde (5 nm) zal sneller boren en creëren een grotere poriën. Een kleinere sensor (1 nm) zal het langer duren om te boren en een kleinere porie.
- Stel de STEM uitlijningen, indien nodig.
- Focus van de nitride membraan en breng het naar een vergroting van x1.3M. Fijn scherpstellen moet worden gedaan door het toezicht op de Ronchigram.
- Als er een beweging van het monster, wacht dan op het monster te stabiliseren. Dit kan tot een uur. Lege de elektronenbundel terwijl u wacht, zodat er geen schade van de nitride.
- Plaats de elektronen probe op het monster en beginnen boren.
- Controleer regelmatig het monster door het scannen met de HAADF detector, zowel om te controleren of de nanogaatje is dri wordtgelogen (het zal er uitzien als een donkere vlek) en om te controleren of er is geen beweging van het monster. Als het monster zweeft een beetje, de positie van het elektron sonde op meer dan de nanogaatje.
- Bekijk de Ronchigram te identificeren wanneer de porie heeft gevormd. Toen in focus, het nitride film heeft een glanzende uitstraling. Dit zal verdwijnen wanneer de nanogaatje formulieren. Aanbrengen van de Ronchigram enigszins onscherp maakt het mogelijk om te zien een Fresnel franje worden geassocieerd met het nanogaatje.
- Maak een beeld van de nanogaatje met de HAADF.
- Doe een intensiteit profiel van de nanogaatje beeld. De diameter van de nanogaatje kan geschat worden door de donkerste gebied van het profiel.
- Uitbreiding van de nanogaatje kan worden uitgevoerd door het verplaatsen van de elektron sonde langs de randen van de porie.
- Zodra de nanogaatje is van de gewenste diameter, zet de S / TEM in de TEM-modus.
- Breng de Monochromator om de standaard instelling en het imago van de nanogaatje met behulp van bright-field TEM om de grootte te bevestigen
2. Bevochtiging van de solid-state nanogaatje
- De-gas gedeïoniseerd water met 1 M KCl, 10 mM kalium-fosfaat, pH 7,4. Dit kan worden gedaan door de oplossingen onder vacuüm en ze in een bad ultrasoonapparaat gedurende 20 minuten.
- Plaats de nanogaatje met silicium nitride chip in een 10 ml Pyrex beker. Zorg ervoor dat u de nitride raam te breken want het is zeer delicaat. Plaats het bekerglas op een kookplaat in een zuurkast en ingesteld op 100 ° C.
- Reinig de nanogaatje chip met piranha oplossing met behulp van grote zorg. Voegt u eerst 3 ml zwavelzuur om de container met behulp van een glazen pipet. Vervolgens voeg voorzichtig 1 ml waterstofperoxide aan het zwavelzuur aan piranha-oplossing 14 te maken. Neem alle voorzorgsmaatregelen.
- Laat de nanogaatje chip in de piranha-oplossing inwerken gedurende 10 minuten.
- Verwijder de piranha-oplossing uit de beker met behulp van een glazen pipet. Plaats deze in een juiste opslag bakje.
- Fill de beker met de ontgast, gedeïoniseerd water met een schone glazen pipet. Lege beker water en herhaal minstens 5 keer.
- Verwijder de nanogaatje chip met schone pincet en droog het met licht zuigen
- Onmiddellijk seal de nanogaatje chip in de kamer (Fig. 2a, 2b). De chip kan worden vastgezet in de kamer door O-ringen of siliconenkit.
- Vul de kamer met KCl-oplossing
- Sluit de Ag / AgCl elektroden op de kamer (Fig. 2b). Elektroden kunnen worden gemaakt door het weken zilveren draad in bleekwater 's nachts.
- Breng een transmembraan potentiaal over de elektroden en toezicht op de huidige reactie met behulp van een Axon 200B patch-clamp versterker in de voltage-clamp-modus.
- Construct een I / V (stroom-spanning) curve van de metingen. De I / V-curve moet zeer lineair bij het gebruik van 1 M KCl (afb. 3). De geleiding van de nanogaatje moeten overeenstemmen met de diameter. Als de nanogaatje niet wordt weergegeven eenlineaire I / V-curve, de geleiding is te laag, of de open stroom van de nanogaatje is niet stabiel (Fig. 4a), betekent dit dat de nanogaatje niet goed bevochtigd en piranha wassen moet worden herhaald.
3. Monitoring eiwitadsorptie
- Het is van cruciaal belang om de controle experimenten uit te voeren met een single-nanogaatje membraan of parallel array van nanoporiën (zie hieronder) om de huidige monitor met de buffer voorwaarden ontbreekt het eiwit monster. Wij raden de volgende twee stappen: (i) het gebruik van een hoge zuiverheid niveau buffer (zuiverheid> 99,9%; chromatografie-grade niveau), en (ii) het gebruik van een buffer waarvan de wisselwerking met de solid-state nanogaatje niet produceren single-channel evenementen. Daarnaast raden we het verkrijgen van een hoge zuiverheid eiwitmonster het gebruik van standaard eiwit chemie procedures. De zuiverheid van het eiwit monster moet worden gecontroleerd door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide (SDS-PAGE) gel-analyse en hoge-resolutie mass spectrometrie 15.
- Voeg een gezuiverd monster van het eiwit te bestuderen in de geaard bad van de kamer. Wacht tot het monster te diffunderen door het bad. Typische concentraties van eiwit dat kan worden gemeten zijn in de tientallen nM tot uM range 7,15-21.
- Breng een transmembraan potentiële spanning vooringenomenheid met de polariteit tegengesteld aan die van de totale lading van het eiwit bestudeerd. Bijvoorbeeld, BSA heeft een effectieve netto negatieve lading bij pH 7,4, en dus een positieve spanning misvatting moet worden toegepast. De aangelegde spanning creëert potentiaalgradiënt binnen de nanogaatje interieur en proteïnen van tegengestelde ladingen zal worden gedreven door tegengestelde krachten. Alleen voltage polariteiten die de eiwitten schijf in de nanogaatje zullen creëren van meetbare signalen.
- Een toegepast potentieel van grootte van 200 mV moet groot genoeg zijn om de meeste eiwitten analyten te observeren. Gebeurtenissen zullen verschijnen als tijdelijke stroom doorbuigingen van de baseline (fig. 4b).Als er geen signaal wordt waargenomen, verhoogt de concentratie van het eiwit in de kamer. Hogere spanningen verbeteren van de signaal-ruisverhouding. Nitride nanoporiën kan weerstaan enkele volts.
- Eiwit adsorptions zal verschijnen als langlevende veranderingen in de baseline stroom van de nanogaatje (fig. 4c).
4. Mogelijkheden voor functionalisering van de nanoporiën
Er bestaan verschillende methoden voor het aanbrengen van functionele groepen aan silicium nitride 22,23. De meeste nitride films hebben een dunne oxidelaag aan de buitenkant en de blootstelling aan ozon kan een extra oxidelaag, indien nodig. Verschillende organosilanen kan worden gebruikt en zelf-geassembleerde op dergelijke lagen. Van bijzonder belang is aminosilaan, die zichzelf assembleert en kan worden gewijzigd verder (dat wil zeggen, carbonzuur en aldehyden), waardoor de inspectie van een reeks van organische oppervlakken. Na een nanogaatje is gewassen met piranha en vastgezet in de chamber, kan amine direct worden toegevoegd aan de kamer bad met een ondersteunend elektrolyt van 0,5 M TBACl (tetrabutylammonium) en watervrij MeOH (methanol) gebruikt als een oplosmiddel. Monolaag vorming kan gevolgd worden door de toepassing van een 400 mV spanning vooroordelen en de meting van de huidige daling van 23.
5. Bepaling van de schijnbare eerste orde reactie snelheidsconstante en de Langmuir adsorptie constante gebruik van parallelle nanogaatje arrays
5.1 De schijnbare eerste-orde reactie snelheidsconstanten voor absorptie en desorptie
We benadrukken dat het positieve aspect van deze methodiek is de mogelijkheid om individuele adsorptions observeren op de single-molecule-niveau. De single-molecule metingen van eiwit-adsorptie op een anorganisch oppervlak kan worden opgeschaald door het gebruik van parallelle reeksen van solid-state nanoporiën. De parallelle reeks van nanoporiën is nodig omdat de noodzaak voor het testen van vele poriën op een betrouwbare statistiek te krijgens. Daartoe zou het gebruik van een nanogaatje reeks de bewaking van de individuele adsorptions evenals het meten van meerdere gebeurtenissen voor verdere analyse. Een reeks van nanoporiën in silicium nitride kan gevormd worden door de bovengenoemde protocol gewoon door het boren van meerdere gaten in het monster. Elke nanogaatje moet van vergelijkbare grootte. Arrays van nanoporiën van 6x6 of 7x7 moet voldoende zijn. Na toevoeging van eiwitten analyt in de kamer, zal de huidige verval in een exponentiële wijze, met een volgende expressie:
Ik heb t = ∞ I - (I ∞ - I 0) exp (-k 't)
Hier, ik t, geeft de stroom bij een experimenteel tijdstip t. I 0 is de oorspronkelijke stroom die door de nanogaatje array. Ik ∞ geeft het huidige niveau bij verzadiging (dwz oneindig). K 'is de schijnbare eerste orde reactiesnelheid een constante, die kan worden bepaald uit ee pasvorm van de experimentele curve. Een grotere k 'kan worden geïnterpreteerd als een snellere adsorptie tarief. De verhouding I ∞ / I 0, ook wel de genormaliseerde verzadigingsstroom, is een dimensieloos getal tussen 0 en 1. Deze parameter is een maat voor de bezetting door de geadsorbeerde eiwit analyten. Daarom moet elk afzonderlijk experimentele conditie worden geassocieerd met twee specifieke output-parameters I ∞ / I 0 en k '.
Opgemerkt moet worden dat de schijnbare eerste orde adsorptie snelheidsconstanten en genormaliseerd stromen worden beïnvloed door de effectieve tijd die eiwitten binnen de nanoporiën. Deze tijd is afhankelijk van de concentratie van het eiwit analyten in bulk waterige fase 24. Daarom is extra correctie van deze nummers dient te worden uitgevoerd op basis van de effectieve tijd die besteed door de eiwitten in de nanogaatje interieur. Wij stellen voor het meten van de frequentie van de fast (translocatie) evenementen en te vermenigvuldigen met de gemiddelde verblijftijd van dergelijke gebeurtenissen. Dit geeft de gemiddelde tijd van de eiwitten besteed binnen de nanogaatje interieur per tijdseenheid.
De snelheidsconstante van desorptie kan worden bepaald met behulp van een parallelle reeks van nanoporiën ook. Zodra het huidige niveau verzadiging (I ∞) bereikt, de spanning moet worden omgedraaid, zodat er geen meer eiwitten zitten gevangen in de nanoporiën. Desorptie van de afzonderlijke eiwitten zal gepaard gaan met de wijziging van de opgenomen stroom naar hogere waarden. Het tarief constant wordt dan uit de stijging van het huidige niveau.
5.2 De Langmuir adsorptie constante
De absorptie van proteïne analyten op de anorganische oppervlakken van de nanoporiën is afhankelijk van de eiwit concentratie in waterige fase. Dit fenomeen is al waargenomen bij de single-molecule level 13. Als θ vertegenwoordigen s de genormaliseerde verzadiging stroom (I ∞ / I 0), dan is een typisch Langmuir isotherm vergelijking wordt gegeven door de volgende uitdrukking:
waar C is het eiwit concentratie in de waterfase. α is de Langmuir adsorptie constant. Deze constante neemt toe met een toename in de bindingsenergie van adsorptie en met een daling van de temperatuur. De verzameling van de gegevens θ punten zal door metingen met een parallel-arrays uit bij verschillende eiwit-concentraties in waterige fase uitgevoerd. De gegevens moeten worden geanalyseerd in combinatie met andere technieken om de omvang van de aangebrachte Langmuir adsorptie constant te controleren. Daarnaast kunnen full-atomistische moleculaire dynamica simulaties 25,26 ook gebruikt worden om de interpretaties van de verkregen experimentele gegevens te helpen.
titel "> 6. representatieve resultaten Typische resultaten voor solid-state nanoporiën zijn als volgt. De open poriën huidige moet zeer stabiel zijn, zoals te zien in Fig. 4a. De I / V kenmerken van de nanogaatje moet zeer lineair in 1 M KCl, 10 kalium-fosfaat, pH 7,4, zoals te zien in Fig. 2. De helling van een lineaire fit aan de I / V-curve zal de unitaire geleiding van de nanogaatje. De geleiding heeft een directe relatie met de nanogaatje diameter en moet overeenkomen met de vergelijking: 
, Waarbij G is de geleiding van de nanogaatje, d is de diameter, l is de lengte, en σ is de geleidbaarheid van de oplossing in de kamer 14. Deze waarde moet overeenkomen met tot binnen 30%. Als het te klein is, wordt uw poriën waarschijnlijk niet bevochtigd. Met toevoeging van eiwitten, moet een snelle gebeurtenissen volgen, zoals te zien in Fig. 4b. Protein adsorptie is een langlevende huidige daling zoals weergegeven in Fig. 4c. Sommige eiwitten zijn zeer labiel en ondergaan structurele transformatie binnen de porie interieur. In dit geval zal de lange levensduur spanningsval gepaard gaan met snelle schommelingen.
Figuur 1. Solid-state nanogaatje vervaardigd met behulp van een Tecnai F20 S / TEM. De porie was geboord in STEM-modus tot een diameter van 20 nm. Het beeld werd genomen in bright-field TEM-modus. Nitride was 30 nm dik.
Figuur 2. Kamer wordt gebruikt voor woningbouw een solid-state nanoporie in resistieve-pulse metingen. A) kamer en een silicium chip met vrijstaande nitride venster (TEM grid). De nanogaatje is geboord in het nitride voorafgaand aan het laden. Rode O-ringen worden gebruikt om een goede s vormpaling over de chip, die twee baden van ionische oplossing scheidt. B) Schema van de kamer laten zien plaatsing van de oplossing baden en elektroden met betrekking tot de nanogaatje.
Figuur 3. Typische I / V sporen voor solid-state nanoporiën van verschillende diameters. Single-channel elektrische sporen werden genomen in 1 M KCl, 20 mM Tris, pH 8,5. Nanoporiën werden geboord in 30 nm dik silicium nitride. Opmerking nitride dikte van invloed op de unitaire geleiding van de nanogaatje.
Figuur 4. Gemeten single-channel de huidige sporen en de detectie van eiwit adsorptie. A) is een single-channel elektrische trace met de open stroom van een 10 nm diameter nanogaatje. B) Huidige doorbuiging vertegenwoordigen compartimentering van de bovine serum albumine (BSA) in de interior van de nanogaatje. C) Adsorptie van BSA op het nitride oppervlak. Alle sporen zijn van dezelfde nanogaatje in 1 M KCl, 10 mM kalium-fosfaat, pH 7,4. De toegepaste transmembraan potentiaal werd +40 mV en de BSA werd toegevoegd aan de geaarde kamer bad bij een concentratie van 120 nM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spontane adsorptie van eiwitten op solid-state oppervlakken 27-29 is van fundamenteel belang in een aantal gebieden, zoals de biochip toepassingen en het ontwerp van een nieuwe klasse van functionele hybride biomaterialen. Eerdere studies hebben aangetoond dat eiwitten geadsorbeerd aan solid-state oppervlakken geen laterale mobiliteit of significante desorptie-tarief is gebleken, en daarom eiwit-adsorptie wordt algemeen beschouwd als een onomkeerbaar en niet-specifieke proces van 30-32. Eiwitadsorptie op solid state oppervlakken is waarschijnlijk te wijten aan verschillende factoren, waaronder elektrostatische en hydrofobe krachten onder de zijketens van de eiwitten en de reactieve groepen in de vaste stof-vloeistof-interface 13.
Het proces van eiwitadsorptie is onderzocht door het aantal benaderingen, zoals kwarts kristal microbalans 28,29, elektronenmicroscopie, 33,34 ellipsometrie, 35 TL-etikettering, 36 en planar polarisatie interferometrie (PPI). 37 Daarentegen deze single-nanogaatje en nanogaatje scala aanpak steunt op de detecteerbare single-channel huidige veranderingen die door de interacties tussen single-eiwit analyten en de nanogaatje interieur.
De meest kritische stap in het bereiken van positieve resultaten is de juiste bevochtiging van het nanogaatje interieur. Indien de porie kenmerken niet aan de specificaties besproken in de resultaten sectie kunnen meerdere methoden voor probleemoplossing gebruikt worden. Tijdelijke stroom blokkades die zich voordoen, zonder eiwitten in de oplossing kan erop wijzen dat de kamer is vervuild. Teflon kamers kunnen worden gewassen met piranha. PDMS kamers moeten worden gemaakt, vers van schone mallen voor elk experiment. Nanoporiën met een kleiner dan verwacht geleiding of niet-lineaire I / V-karakteristieken kan erop duiden dat nat is mislukt. Een korte toepassing van hoge spanning (~ 5 V) kan het verbeteren van de elektrische eigenschappen van de nanogaatje.Anders moet de nanogaatje opnieuw worden gewassen met de piranha-oplossing. Zelfs in de beste omstandigheden, sommige nanoporiën niet goed nat. De mogelijkheid om een nanogaatje nat is afhankelijk van de afmetingen. Beide dunner nitride nanoporiën en grotere diameter nanoporiën zijn makkelijker te nat dan dikkere nitride nanoporiën of kleinere diameter nanoporiën. Voor 20 nm dik nanoporiën met een straal van 5 nm het slagingspercentage is ongeveer 70% na de eerste wassen. Voorzichtigheid is geboden bij het selecteren van een nanogaatje formaat voor uw analyt, want nanoporiën moet groot genoeg zijn om het eiwit te passen.
Het protocol hier besproken alleen van toepassing op adsorptie aan een silicium nitride oppervlak. Andere oppervlakken, zoals siliciumoxide 9 of alumina 23 kunnen ook worden geboord met behulp van deze techniek, maar het aantal van dunne films vatbaar om deze techniek is beperkt tot diegenen die zo kan worden geproduceerd dat ze vrij-staande, dunne en vrij van gaatjes . Om dit probleem te overwinnen chemical coating van de nanogaatje kan worden gebruikt 23,38-40. Een andere afweging van de interne nanogaatje techniek is dat het alleen kan op een molecuul blik op een moment. Om dit beperking, boden we een alternatief, het gebruik parallelle arrays van solid-state nanoporiën 41. De huidige metingen met nanogaatje arrays bieden een kans om macroscopische kinetische parameters, zoals de schijnbare eerste orde reactie snelheidsconstanten van absorptie en desorptie te verkrijgen. Bovendien zou deze aanpak kan de bepaling van de Langmuir adsorptie constant. Een onmiddellijke beperking van deze techniek is het onvermogen om informatie te verzamelen over vlakke en brede oppervlakken. De metingen zullen alleen sonde eiwitadsorptie in besloten ruimten van het interieur van de gefabriceerde solid-state nanoporiën. In veel gevallen is het heel uitdagend om precieze informatie over de geometrie en de binnenkant van de nanogaatje te verkrijgen. In het verleden was eiwitadsorptie uitgebreid te onderzoekend door kwartskristal microbalans 28,29. Het eiwit adsorptie op het kristal oppervlak gaat gepaard met een demping van de opgelegde een oscillerende beweging van het kristal microbalans, het produceren van een daling van de resonantiefrequentie. Een wijziging van de totale massa gekoppeld te wijten aan proteïne adsorptie leidt tot een frequentie verschuiving van de kwartskristal microbalans. De totale geadsorbeerde eiwit massa is lineair gerelateerd aan de frequentie verschuiven. Dit is het onderliggende principe van deze techniek, die indirect sondes eiwitadsorptie op een goed gedefinieerde vlakke ondergrond. In tegenstelling tot het gebruik van nanogaatje arrays gebruikt de resistieve-pulse techniek die nauw vergelijkbaar is met de Coulter Counter benadering 42. Nogmaals, kan de nanogaatje techniek worden opgeschaald tot een beperkt aantal nanoporiën in een membraan, zodat individuele adsorptions bekeken kan worden in real time. In tegenstelling tot kwartskristal microbalans, de nanogaatje metingen kunnen niet beoordelen de adsorptie-proces op grote schaal envlakke ondergrond, waarin de extra gebeurtenissen kan voorkomen (dat wil zeggen, laterale diffusie van geadsorbeerd eiwitten), waardoor de productie van wijzigingen in de Langmuir adsorptie-isothermen. Natuurlijk, is het wenselijk dat deze benaderingen gewijd aan eiwitadsorptie moet worden gebruikt in combinatie met elkaar, omdat ze slechts enkele aspecten van de adsorptie proces sonde. Bijvoorbeeld, Brewer en collega's gebruik van een combinatie van een kwartskristal microbalans en ζ-potentieel technieken om aan te tonen dat de BSA binding op gouden nanodeeltjes en goud oppervlakken vindt plaats via een elektrostatische mechanisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag John Grazul (Cornell University), Andre Marziali (The University of British Columbia in Vancouver) en Vincent Tabard-Cossa (The University of Ottawa) bedanken voor hun advies. Dit werk is deels gefinancierd door subsidies van de Amerikaanse National Science Foundation (DMR-0706517 en de DMR-1006332) en de National Institutes of Health (R01-GM088403). De nanogaatje boren werd uitgevoerd op de Electron Microscopy Facility van de Cornell Center for Materials Research (CCMR) met steun van de National Science Foundation - Materials Science and Engineering Research Centers (MRSEC) programma (DMR 0520404). De voorbereiding van de siliciumnitride membranen werd uitgevoerd aan de Cornell nanoschaal Facility, een lid van het National Nanotechnology Infrastructure Network, die wordt ondersteund door de National Science Foundation (Grant ECS-0335765).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tecnai F20 S/TEM | FEI | S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source. | |
| 20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM | SPI Supplies | 4163SN-BA | |
| Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| silicone O-rings | McMaster-Carr | 003 S70 | Alternatively use PDMS |
| silver wire | Sigma-Aldrich | 348759 | For electrodes |
| SPC Technology, D sub contact, pin | Newark Inc | 9K4978 | For electrodes |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber. | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | KWIK-CAST | Fast acting silicone sealant |
| hot plate | Fisher Scientific | ||
| Faraday cage |
References
- Li, J. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, 166-169 (2001).
- Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope. Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).
- Dekker, C.
- Branton, D. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).
- Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient. Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).
- Peng, H., Ling, X. S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers. Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).
- Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).
- Zhao, Q. Detecting SNPs using a synthetic nanopore. Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).
- Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision. Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).
- Sexton, L. T. Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor. J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).
- Martin, C. R., Siwy, Z. S. Chemistry. Learning nature's way: biosensing with synthetic nanopores. Science. 317, 331-332 (2007).
- Sexton, L. T. An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing. J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).
- Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface. J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).
- Han, A. Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores. Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).
- Han, A. Sensing protein molecules using nanofabricated pores. Appl. Phys. Lett. 88, (2006).
- Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore. Appl. Phys. Lett. 91, (2007).
- Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis. Nano. Lett. , (2010).
- Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. Data analysis of translocation events in nanopore experiments. Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).
- Oukhaled, A. Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force. ACS. Nano.. , (2011).
- Yusko, E. C. Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls. Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).
- Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).
- Wanunu, M., Meller, A.
- Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore. Biophys. J. 85, 897-910 (2003).
- Aksimentiev, A. Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore. Nanoscale. 2, 468-483 (2010).
- Timp, W. Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life. IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).
- Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry. J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).
- Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes. J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).
- Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces. Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).
- Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy. Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).
- Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events. J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).
- Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin. Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).
- Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips. Scanning. 21, 394-397 (1999).
- Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures. Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).
- Giannoulis, C. S., Desai, T. A. Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films. J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).
- Gustavsson, J. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications. J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).
- Shirshov, Y. M. Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface. Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).
- Chen, P. Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores. Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).
- Siwy, Z. Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes. J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).
- Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore. Anal. Chem. , (2009).
- Kim, M. -J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).
- Bezrukov, S. M. Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport. J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).
