Summary
该协议的细节肽易位到大量的unilamellar脂质囊泡的定量测量方法。这种方法还提供了关于膜易位率的信息，可用于识别肽，有效地和自发地跨越脂质双层。
Abstract
有一个多肽的积极关注，容易交叉没有细胞膜，细胞膜上的受体1协助。其中许多被称为细胞穿透肽，这是经常为他们的潜力作为药物载体 1-3注意到。此外，有越来越多的利益通过非4,5膜裂解机制，特别是那些跨而不引起细胞裂解细菌细胞膜并杀死细胞与细胞内过程的干扰 6,7抗菌肽。事实上，越来越多的作者指出，细胞穿透和抗菌肽1,8之间的关系。膜移位和肽的结构，其转运能力之间的关系过程中的一个坚定的认识需要有效的，重复性检测易位。一些团体提出的方法来衡量大unilamel易位LAR脂质囊泡（LUVs）9-13。 LUVs作为有用的模式细菌和真核生物的细胞膜和肽 14,15荧光研究中经常使用。在这里，我们描述了我们的第一考虑如抗菌肽magainin和buforin二16,17，松崎和同事开发的方法的应用程序。除了这种方法为我们的协议，我们也提出一个简单的数据分析方法，量化易位使用这种检测能力。这种易位检测的比别人的优点是，它有可能提供膜易位率的信息，不需要另外一个荧光标签，可以改变肽属性18，含色氨酸的肽。简单地说，易位到脂质囊泡的能力是衡量本地色氨酸残基和D之间的福斯特共振能量转移（FRET）的功能与外部相关的蛋白质时，LUV ansyl磷脂膜（图1）。细胞穿透肽裂解，因为他们遇到不羁的胰蛋白酶封装的LUVs，LUV膜和下降的FRET信号解离。在DROP FRET为转位肽观察到的信号是明显高于观察LUVs含有胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂，或当不自发地穿过脂膜是一种肽暴露在含有胰蛋白酶LUVs相同的肽。这种荧光的变化提供了直接量化，随着时间的推移肽移位。
Protocol
1。制备大Unilamellar脂质囊泡（LUVs）
- 准备LUVs作为细胞膜模拟检测19。
- 混合磷脂（POPC，760.10克/摩尔），磷脂（POPG. 770.99克/摩尔），5 dimethylaminonaphthalene - 1 -磺酰磷脂（DNS教皇，994.350克/摩尔）（阿凡提极性脂）在氯仿中溶解在50 ：45:5的比例。由于每个检测需要单独编制的实验和控制LUVs，两个脂质蛋糕小瓶应准备。 0.376毫克总脂质（POPC 0.188毫克，0.169毫克POPG，和0.019毫克DNS教皇）通常是足够的，以弥补单一的易位试验足够的囊泡。
- 去氯仿使用的N 2气流蒸发。
- 9-14小时在真空干燥器干燥脂质蛋糕。
- 准备一只股票10毫米HEPES缓冲溶液（10 mM的HEPES，238.3克/摩尔，45毫米氯化钠，58.44克/摩尔，1 mM EDTA的372.24克/摩尔pH值7.4）。 HEPES缓冲是ST有色在4 ° C。
- 准备在10毫米准备HEPES缓冲液原液的0.4毫米猪胰蛋白酶（23.3公斤/摩尔）。胰蛋白酶是储存在-20 ° C，并在实践中，通常不接受使用前超过2冻融。
- 准备在10 mM的HEPES缓冲的解决方案和存储于-20 ° C原液的4.0毫米鲍曼- Birk胰蛋白酶抑制剂（8公斤/ MOL）在我们的使用，这种股票是每月补充和通常不接受前再次它是由冻结/解冻周期超过3。
- 重组实验multilamellar囊泡（MLV更具）加入等体积的0.4毫米胰蛋白酶的股票和10毫米的HEPES缓冲溶液干脂质蛋糕的胰蛋白酶溶液在0.2毫米。对于单个样品的0.376毫克总脂，150μL胰蛋白酶溶液和150μLHEPES缓冲的混合物就足够了。
- 在加入同等体积为0的解决方案，0.2毫米胰蛋白酶和2.0毫米鲍曼- Birk胰蛋白酶抑制剂的重组的控制MLV更具。4毫米的胰蛋白酶股票和4.0毫米的胰蛋白酶抑制剂的干脂质蛋糕。对于单个样品的0.376毫克总脂，150μL胰蛋白酶溶液和150μL胰蛋白酶抑制剂的混合物就足够了。
- MLV的传输解决方案，从玻璃瓶到1.7 ml离心管。
- 主题MLV 5冻结/解冻周期的解决方案，在液氮中。
- 准备放置两个过滤器支持在每个聚四氟乙烯挤出一块蘸HEPES缓冲脂挤出机（阿凡提极性脂）。放置一个0.1微米的毛孔（滤纸，英国），两者之间的聚四氟乙烯挤出件在nuclepore跟踪蚀刻膜，并将其放在金属挤出机筒挤出机内件。紧缩的挤出机筒的金属的顶端持有人，并把它放在前两个挤出件甜甜圈间隔。
- 填写挤出机内的空隙体积500μL，10毫米的HEPES使用250μL玻璃注射器，以防止损失囊泡样品的缓冲区。</ LI>
- 每个MLV的样品装入挤出机，并推动通过膜的样品，至少有21次，以确保统一的unilamellar囊泡大小。 LUVs获得MLV解决方案以下挤出。
- 储存于4 LUVs ° C和48小时内使用。
2。量化LUV浓度
- LUV浓度进行了量化，确定样品中的 20的总磷含量。
- 准备8.9 NH 2 SO 4 nanopure水，在室温下存储。
- 准备了2.5％W / v钼酸铵六（588.04克/摩尔）nanopure水的解决方案。准备了10％W / V抗坏血酸（176.1克/摩尔）在nanopure水的解决方案。从覆盖的管带箔的光线照射保护的抗坏血酸溶液。长达2个月，保存于4 ° C的两种解决方案。
- 准备为0.65毫米的磷酸盐缓冲溶液（二氢无水磷酸钠，120克/摩尔）。
- 准备6个标准TU。BES。标准应包含0.0μL，50μL（0.0325μmoles），100μL（0.065μmoles），175μL（0.114μmoles），250μL（0.163μmoles），或350μL磷溶液（0.228μmoles）。
- 准备LUV一式三份样品管。每个样品管应包含约0.1 LUVsμmoles。实验组和对照我必须单独计量的浓度。
- 要纠正任何Bowman - Birk抑制剂粉干磷盐，控制LUV必须准备的空白。空白应该包含相同体积的0.2毫米trypsin/2.0 mM的Bowman - Birk抑制剂的解决方案，如被放置在控制LUV样品管。
- 将450微升8.9 NH 2 SO 4到每个样品，标准和空白管。
- 热样品，标准，和25分钟的空白，在175-210 ° C在烤箱。
- 删除所有的管子，让他们冷却。加入150μL30％H 2 O 2涂BES。
- 热样品，标准和30分钟的空白，在175-210 ° C。
- 取出的样品，标准，并从热的空白。如果任何解决方案都尚未无色，添加50μL的H 2 O 2所有热管和一个额外的15分钟在175-210 ° C。
- 添加3.9毫升nanopure H 2 O，0.5毫升钼酸铵溶液和0.5 mL的抗坏血酸溶液每管。
- 在沸水浴中加热5-7分钟管。
- 测量每个标准和样品使用Agilent 8453紫外可见分光光度计在820 nm的吸光度。管含有0.0 mmoles磷应使用所有标准和实验的空白LUV样本。管含有0.2毫米trypsin/2.0 mM的Bowman - Birk抑制剂的解决方案应作为控制的空白LUV样本。
- 线性吸光度与磷含量的标准曲线，可以生产和使用，计算出总的磷酸化orus内容和LUV样品的浓度。
3。准备肽解决方案
- 在nanopure H 2 O的溶解肽在本实验中使用的描述肽必须包含一个色氨酸残基。
- 测量肽的解决方案一式三份于282 nm的吸光度。色氨酸5700 M -1 cm -1处的摩尔消光系数计算肽浓度。
- nanopure水稀释到终浓度为30微米的肽。贮存于-20 ° C
4。易位量化
- 准备在1.7 ml离心管实验组和对照样本。每个解决方案中添加足够的LUVs终浓度为250微米。加入足够的Bowman - Birk抑制剂的解决方案，使抑制剂终浓度为10倍大于胰蛋白酶浓度。添加足够的10毫米HEPES缓冲带来的最终解决方案的体积为450μL。 <李>广场50μL成Starna微石英荧光细胞肽的解决方案。 LUVs和多肽之间的比例是高到足以确保几乎所有完整的肽是在足够接近接近到丹磺酰组给予的FRET信号，即使没有进入囊泡易位。这是类似的FRET在控制条件下观察到的肽和不转运入囊泡。
- 新增实验或对照样品在试管的肽解决方案。这应该带来最终的肽浓度至3微米。
- 开始25分钟的荧光动力学实验或控制后除了实验立即LUV解决方案，至少一次到每秒荧光阅读。激发波长在280 nm，发射波长为525 nm，温度设定为25 ° C使用Cary Eclipse荧光分光光度计，我们设置的光电倍增管的灵敏度高。
5。生成定量易位比例
- 定义为初始荧光（F O）后15秒的数据收集荧光读。在我们的仪器设置中，我们发现，第一个15秒采集的荧光数据是不可靠的，由于混合，关闭样品室，和其他干扰后，样品除了系统。 F O除以每个随后的阅读，以获得在每个时间点相对荧光（F / F 0 ）。
- 平均所有实验的最后一分钟的相对荧光读数获得最终的平均相对荧光
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。 - 除以由控制样品实验样品获得一个正确的最终荧光值。
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。 图2显示了这个有代表性的肽，表现出强劲的易位的检测结果。在这个实验中的信号（黑色线），显示了在经过一段时间的FRET信号的显着下降。但是，重要的是要控制的FRET信号，由于不完整的胰蛋白酶抑制或易位能力无关的其他因素的潜在损失。为此，我们也总是测量FRET信号之间的肽和LUVs含胰蛋白酶和鲍曼- Birk胰蛋白酶抑制剂（灰色轨迹，图2）。在我们的手中，它已被控制每一个实验运行时执行每肽。这使我们能够清楚正确的信号的任何变化，由于脂质囊泡制剂或仪器噪声，可用于相对较弱的荧光信号通常是在观察这些浓度显著之间的任何分歧。
控制EXPE的重要性riment使用LUVs含有胰蛋白酶抑制剂是强调了在图3所示的数据。在这种情况下，肽信号减少类似数额，在图2实验样品（黑色曲线）。然而，控制的示例显示了这种肽更快速的减少，因此其净易位是较低的。
我们的协议第5条描述了一个简单的方法，从这个实验中量化易位。更高的易位比率肽转运有效的指标，图2所示为细胞穿透肽的易位的比例是1.16，而弱转位肽易位比率接近1。根据我们的经验，不同的囊泡准备进行3次独立实验的标准误差为0.01至0.06的范围内。
图1。示意图translocat离子检测实验LUV样本（ 一 ）掺杂荧光丹磺酰教皇（黑网吧），包含封装胰蛋白酶（剪刀）。胰蛋白酶抑制剂（红色圆圈）是用来抑制胰蛋白酶外LUVs。 LUVs暴露肽（紫色）。肽与LUV膜产生的FRET信号（绿色），跌幅translocting肽遇到不羁的内部胰蛋白酶。胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂是控制封装LUV样品（B）来衡量的FRET信号，以易位无关的跌幅。
图2。一个细胞穿透肽的有代表性的数据 。一个代表转位的抗菌pepide，显示了FRET的信号相比，其控制的显著下降。
图3。突出控制的重要性。代表性的数据不完全抑制非转位肽胰蛋白酶消化，导致在FRET的信号随着时间的推移下降，在实验组和对照LUV的解决方案。由于控制和实验的痕迹之间的差异相对较小，这种突变的特点是作为一个弱转位肽。
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Discussion
这里介绍的协议，可用于评估脂质囊泡的内部和外部的肽浓度的相对变化。这些变化与易位的能力。这个协议可以被用来确定细胞穿透肽作为药物载体的潜力。由于细胞穿透肽的兴趣的增长，这将是有趣的，看看如何采用定量的方式开发和使用方法，直接测量易位事件。
在我们的实验室中，我们发现，可以通过仔细监测几个特定方面的实验提高检测的一致性。首先，实验组和对照囊泡量化，提高了使用该协议取得的结果一致。此实验还取决于能力，检测准确的初始荧光蛋白质易位和消化开始之前。因此，它是必不可少的荧光灯scence信号的采集，尽快开始的蛋白质或多肽暴露LUV解决方案。此实验也很敏感，特别是胰蛋白酶抑制剂，用于到今天为止，我们已取得了鲍曼- Birk胰蛋白酶抑制剂（Sigma公司的T - 9777）的最一致的结果。重要的是，在控制的情况下观察到的退化程度似乎显著差异肽（在图2和3所强调），并在一些相同的肽不同的囊泡准备情况下。这进一步强调了需要运行的控制每一个实验复制。作为一个额外的控制，也可以测量暴露一个囊泡含有既不的胰蛋白酶，也不胰蛋白酶抑制剂的肽FRET响应。然而，这种控制不提供任何额外的信息是必要的，以评估数据肽易位。
一个问题是膜催化肽通透膜足够允许胰蛋白酶或胰蛋白酶抑制剂穿越膜。本文的例子使用的肽已被证明造成膜通透性小。尽管如此，许多膜裂解肽也适合此类似易位检测9,16,21,22。这可能是因为体积更大的比内囊泡外。因此，任何胰蛋白酶，泄漏出的囊泡可以抑制多余的胰蛋白酶抑制剂，防止任何囊泡以外的肽裂解。因此，从这个实验的积极结果很可能是指一种肽类区转移而造成相对最小的膜破坏，防止泄漏入囊泡抑制剂。无论如何，彻底肽属性表征应包括膜通透性的评估。
此实验是服从一个更广泛的实验情况下的适应。鉴于易位是一个有趣的测量ction的FRET信号蛋白和膜之间，作为描述这个实验是最适合的蛋白质和多肽自发地与阴离子LUVs副，包含一个色氨酸残基和胰蛋白酶切点附近的色氨酸残基。色氨酸接近切割现场，确保该片段含有色氨酸微不足道的膜亲和力，因此可以忽略不计的FRET信号。但是，我们也可以使用囊泡含有适当的含酪氨酸或其他化学共轭荧光moities的多肽的FRET受体。同样，胰蛋白酶可以被替换为另一个目标替代削减网站在利益的肽的蛋白酶。然而，改变酶和抑制剂，可能需要额外的优化，因为一些市售trypsins和胰蛋白酶抑制剂导致囊泡样品聚合或不稳定。通过改变脂质组成的LUVs，这也可能被用来检测，以确定的作用，脂质费或结构起着决定肽易位。此外，该法还可以随时调整，提供易位高通量测量方法类似Wimley和同事 9 。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想感谢埃莉诺弗莱明和杰西卡陈有益的讨论。经费是由国家过敏和传染病研究所（NIH - NIAID的）奖R15AI079685和研究公司科特雷尔科学学院奖。由霍华德休斯医学研究所和斯特利基金，附加学生提供了支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipid, Inc | 840457C | |
| 1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipid, Inc | 810330C | |
| 16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457C | |
| Porcine trypsin | Sigma-Aldrich | T-0303 | |
| Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9777 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A1417 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt Baker Inc. | 5240-05 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-3375 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S-0751 |
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