Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Cre-P לקס גישה רקומבינציה לצורך זיהוי של Fusion Cell In vivo doi: 10.3791/3581 Published: January 4, 2012

Summary

שיטה כדי לעקוב אחר איחוי תא אורגניזמים חיים על פני זמן מתואר. הגישה מנצל Cre-

Abstract

היכולת של שני תאים או יותר מאותו סוג הפתיל נוצל metazoans במהלך האבולוציה כדי ליצור איברים מורכבים רבים, כולל שרירים ועצמות השלד, ואת השליה. מחקרים עכשוויים מראים היתוך של תאים מאותו סוג מעניקה פונקציה משופרת. למשל, כאשר תאים trophoblast של הפתיל את השליה לטופס syncytiotrophoblast, syncytiotrophoblast הוא טוב מסוגל להעביר חומרים מזינים והורמונים דרך מחסום אימהית, העובר מאשר trophoblasts unfused 1-4. מחקרים מאוחרים יותר מראים היתוך של תאים מסוגים שונים יכול לכוון גורל התא. "חזרה" או שינוי גורל התא על ידי היתוך חשבו פעם להיות מוגבל במערכות תרבית תאים. אבל הופעתו של השתלת תא גזע הובילו לגילוי על ידינו ואחרים בתאי גזע יכול להתמזג עם תאים סומטיים in vivo ו היתוך המאפשר בידול תא גזע 5-7. לפיכך, המיזוג התא תהליך מוסדר גapable לקידום הישרדות התא בידול ולכן יכול להיות בעל חשיבות מרכזית לתיקון הפיתוח של רקמות ואפילו בפתוגנזה של המחלה.

הגבלת המחקר של היתוך התא, הוא היעדר טכנולוגיה מתאימה 1) לזהות במדויק מוצרים היתוך ו 2) היתוך מוצרים לעקוב לאורך זמן. כאן אנו מציגים גישה חדשנית לטיפול הן המגבלות באמצעות אינדוקציה של פליטת אור על היתוך (איור 1):. פליטת אור ניתן לאתר עם ​​רגישות גבוהה in vivo 8-15 אנו מנצלים לבנות קידוד בלוציפראז גחלילית (Photinus pyralis) הגן ממוקם בסמוך קודון להפסיק מוקף רצפים LoxP. כאשר תאים להביע את הפתיל גן עם תאים המבטאים את חלבון recombinase Cre, אתרי LoxP הם ביקע את האות לעצור הוא נכרת ומאפשר שעתוק של בלוציפראז. בגלל האות inducible, שכיחות חיוביות שגויות אותות נמוך מאוד. בניגוד לשיטות הקיימות אשר מנצלים את Cre / מערכת LoxP 16, 17, יש לנו שולבו "חי" אות זיהוי ובכך להרשות בפעם הראשונה את ההזדמנות כדי לעקוב אחר קינטיקה של איחוי תאים in vivo.

כדי להדגים את הגישה, עכברים בכל מקום בגוף להביע Cre recombinase שימש מקבלי בתאי גזע transfected עם לבנות להביע את הזרם בלוציפראז של קודון עצירה floxed. בתאי גזע הושתלו באמצעות הזרקה intramyocardial ואחרי ניתוח השתלת intravital תמונה נערך כדי לעקוב אחר נוכחות היתוך מוצרים הלב הרקמות הסובבות לאורך זמן. גישה זו יכולה להיות מותאם לנתח איחוי תאים בכל סוג רקמה בכל שלב של המחלה ופיתוח, או לתקן רקמות מבוגר.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. תא התורם transfection

  1. Mesenchymal קציר בתאי גזע (MSCs, שמקורם בתאי גזע עובריים H1 נתרם באדיבות על ידי ד"ר Peiman Hematti; לחילופין, כל סוג תא של כל מיני שיערו הפתיל in vivo יכול להיות מועסק), כאשר 70-80% ומחוברות עם 1X טריפסין (Mediatech, Manassas VA) במשך 5 דקות. להשבית טריפסין עם המדיום α-ממ מלא (ללא אנטיביוטיקה, Invitrogen, Carlsbad CA) 18. צנטריפוגה ב XG 300 דקות 5.
  2. בזהירות לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל של 1X PBS ו לספור תאים באמצעות hemacytometer.
  3. העברת 1.5 x 10 6 תאים צינור 1.5 צנטריפוגות מ"ל. צנטריפוגה ב XG 300 דקות 5.
  4. בזהירות לשאוב supernatant. Resuspend גלולה ב 300 μL של R חוצץ (מערכת נאון transfection, Invitrogen) ו 6 מיקרוגרם (2 מיקרוגרם / 5.0 x 10 5 תאים) של p231 pCMVe-betaAc-STOP לוק (Addgene, Cambridge, MA). מקום 3 מ"ל של הצפת E (Invitrעוגן) ליציאת electroporation עגינה לכל פרוטוקול של היצרן (מערכת transfection נאון, Invitrogen).
  5. העברת התא הפלסמיד פתרון טיפ 100 Neon μL pipet ו electroporate עם משך פעימה של 20 אלפיות ו גודל של 1500 וולט. המקום electroporated תאים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל מכיל 9.7 מ"ל α-ממ בינוני מלא.
  6. חזור על שלב 1.5 פעמיים נוספות ותאי בריכה transfected להניב בנפח כולל של 10 מ"ל. מוסיפים 10 מ"ל תא ההשעיה (1.5 x 10 6 תאים) כדי T175 בקבוק המכיל 10 מ"ל α-ממ בינוני מלא. כדאיות התא לאחר electroporation הוא כ 30%, תשואה של כ 4.5 x 10 5 תאים לכל קיימא T175.
  7. שנה α-ממ להשלים בינוני 24 שעות לאחר transfection.
  8. קציר transfected תאים כאשר 70-80 ומחוברות% (~ 2 - 3 ימים לאחר electroporation). בצעו ספירת תאים באמצעות hemacytometer ו resuspend התאים בריכוז של 1.0 x 10 6cells/50 μL של המדיום α-ממ להשלים. מזעור התאים זמן לבלות ההשעיה כדי להפחית מוות של תאים לפני ההזרקה.

2. Intramyocardial Injection

  1. להשרות הרדמה על ידי isoflurane (פיניקס Pharmaceuticals, Inc, סנט ג'וזף, מיזורי) על העכברים הטרנסגניים מהונדסים constitutively להביע Cre recombinase בכל תא (B6.C-Tg (CMV-cre) 1Cgn / J, ג'קסון מעבדה, בר הרבור, ME).
  2. הסרת שיער מאזור החזה באמצעות קוצץ שיער או שיער מסיר כימי.
  3. לצנרר עם קטטר 18 מד (בקטון דיקינסון ושות', פרנקלין לייקס NJ) ומקום למכונת הנשמה העכבר 120-130 נשימות לדקה עם נפח של שבץ μL 150.
  4. בצע חתך לרוחב פני השטח צלעי fourth ובכך לייצר פתיחת בית החזה.
  5. לדמיין את הלב, לעשות שני 25 זריקות μL ההשעיה תא transfected באמצעות מזרק 1 מ"ל (Temuro רפואי Corporation, Somerset, NJ) ו - 28 מחט מד (Bectעל דיקינסון ושות', פרנקלין לייקס NJ). כדי להקל על הזרקת intramyocardial ולמנוע נזק מוגזם האיבר, לכופף את ראש מחט ~ 90 מעלות.
  6. בעקבות הזריקה, להשתמש בתפרים נספגים (למשל, vicryl) כדי לסגור את הצלעות שכבות השריר. עור תפר סגור באמצעות ניילון משי או 4-0.
  7. אפשר העכבר כדי להתאושש הרדמה extubate.
  8. קבוצות הבקרה צריכה לכלול עכברים Cre קבלת זריקות בינוני בלבד, עכברים Cre לקבל את אותו ריכוז של תאים untransfected ועכברים סוג בר קבלת תאים transfected (לחלופין, עכברים Cre קבלת תאים transfected לא נוטה הפתיל).

3. Biophotonic הדמיה

  1. חמש עד חמש עשרה דקות לפני הדמיה, intraperitoneally (IP) להזריק 10 μL לגרם משקל גוף העכבר של 15 מ"ג / מ"ל ​​D-Luciferin (Caliper מדעי החיים, Hopkinton, MA).
  2. להשרות הרדמה על עכברים באמצעות isoflurane ב 4% לזירוזד 1-2% לצורך תחזוקה.
  3. מקום עכברים פרקדן בתיבת הדמיה עם facemask מתן 1-2% isoflurane עבור הרדמה תחזוקה (מערכת הדמיה Xenogen Biophotonic, Hopkinton, MA). מספר העכברים ניתן הדמיה במקביל. תמונה דמה עכבר שליטה עם עכברי הניסוי לצורך השוואה קלה של האות זורח.
  4. באמצעות תמונה Living תוכנה (Xenogen), לקבוע זמן החשיפה המתאימה (בדרך כלל 60 שניות, לראות תוצאות). הגדרת שטח של התמונה כך שתתאים עכברים לשמור אזור עקביות לאורך הדמיה כדי למנוע שינויים ברגישות. קביעת גובה הנושא 4.5 ס"מ.
  5. רוכשת את עוצמת הארה האות המתאים העכבר או עכברים בתחום להציג ולשמור קבצי תמונה ללא שינוי. תמונות תהליך להסיר אות הרקע המתאים כדי לשלוט או עכבר unmanipulated. ערכים עוצמה מעל רקע מתאימות התאים התמזגו בתוך החיה. ניתוח עוצמת ניתן לבצע באמצעות תמונה Living תוכנה (Xenogen) או קוד פתוח תוכנה לניתוח תמונה. T ypically, באזור של עניין (ROI) נבחרה כדי להשוות נתונים בין עוצמת ניסויים בבעלי חיים.

4. נציג תוצאות

כדי לקבוע את הרגישות של מערכת הדמיה Biophotonic Xenogen, קו תאים אשר constitutively מבטא בלוציפראז (231-Luc-D3H1, Xenogen) נמסר שריר הלב של C57/Bl6 עכברים (ג'קסון מעבדה). הוזרקו תאים בריכוזים של 1 x 10 6, 1 x 10 3, או 1 1 x 10 תאים. שש שעות לאחר הלידה התא, הוזרקו לעכברים intraperitoneally עם luciferin הדמיה באמצעות מערכת Xenogen. אות מסוים יכול להיות מזוהה עם 1,000 תאים (2 של 6 עכברים הדמיה, איור 2), אבל היה זיהוי אמין יותר עם ​​10,000 תאים (6 מתוך 6 עכברים הדמיה). חשוב לציין כי מחקר זה שימש גם להקים מתאם גס בין מספר בלוציפראז-להביע תאים ועוצמת האות.

> כדי להדגים את התועלת של פרוטוקול המתואר גילוי ומעקב אחר איחוי תאים, MSCs היו transfected עם LoxP-Stop-LoxP-בלוציפראז פלסמיד (Addgene) ונמסרו שריר הלב של Cre-לבטא בעכברים. כשבוע לאחר הלידה התא, העכברים היו הדמיה הראשון באמצעות מערכת Xenogen ללא הזרקה D-luciferin. כצפוי, ללא מצע האנזימטית, עוצמת האות לא זוהה (איור 3). בשלב הבא, D-luciferin שהוזרק intraperitoneally ואת האות המתאימה לעוצמת בלוציפראז ובכך איחוי תאים התגלה בשניים מתוך ארבעה עכברים שנבדקו. איתות דומה התגלתה שבוע מאוחר יותר (איור 3), מה שמרמז MSC מצמידים מוצרים היתוך יכול להישמר in vivo. במקרה זה, המחקר הופסק כדי לאפשר הערכה של הלב הרקמה שמסביב, אבל אפשר לחזות לטווח ארוך ניתוחים הדמיה תכופות יותר כדי לעקוב אחר התפשטות, תחזוקהד אולי הגירה של מוצרים היתוך בעכברים.

איור 1
באיור 1. סכמטי של טכניקה לזהות Fusion Cell in vivo. היתוך בין אם Cre-לבטא בתאי עכבר התאים המושתלים להביע פלסמיד בלוציפראז floxed מתרחשת, בלוציפראז יבוא לידי ביטוי. בלוציפראז ניתן לאתר על ידי הזרקת המצע האנזימטית, D-luciferin, לעכבר ולאחר מכן הדמיה את העכבר באמצעות הדמיה Biophotonic Xenogen System (מעובד מתוך 19)

איור 2
באיור 2. רגישות הזיהוי של בלוציפראז-להביע תאים ברקמת הלב עם הדמיה biophotonic. קו תאים אשר constitutively מבטא בלוציפראז (231-Luc-D3H1, Xenogen) נמסר בחלל intramyocardial C57/Bl6 של עכברים שונים מספרים על תא הכולל. נציג תמונות של עכברים מחדשceiving 1 x 10 6, 1 ו - 3 x 10 x 10 1 1 תאים (משמאל לימין) מוצגים, הדמיה נערך כ -6 שעות לאחר ההזרקה.

איור 3
באיור 3. כימות בשנת הארה Vivo אינדיקטיביים של Fusion Cell. MSCs היו transfected עם LoxP-Stop-LoxP-בלוציפראז פלסמיד ונמסרו שריר הלב של Cre-לבטא בעכברים. כשבוע ושבועיים לאחר הלידה התא, עכברים Cre היו הדמיה באמצעות מערכת Biophotonic Xenogen הדמיה כדי למדוד את עוצמת הארה מעיד על איחוי תאים. (א) כיסוי של הצילום ואת עוצמת הארה של זיוף ועכברים 1-4 (משמאל לימין) 17 ימים לאחר הלידה התא. (ב) עוצמת הארה של זיוף ועכברים 1-4 (משמאל לימין) 17 ימים לאחר הלידה התא. אזור של אינטרס נבחר (צהוב) המתאים הזריקה ואני עוצמתevels נקבעו באמצעות ImageJ (מקור חינם) תוכנה 20. (ג) עוצמת הארה היה מנורמל לאזור באותו עניין על זיוף העכבר על כל תנאי הניסוי. באותו שבוע, 3 ו -4 עכברים הראו אות הארה חיובי המצביע על היתוך ספונטני של תא עכבר MSC המושתלים. האות התמיד העכבר 3 ב שבועיים. כדי לקבוע איבר ספציפי לוקליזציה של האות המתאים העכבר 3, חלל בית החזה נחשף ואיברים העיקרי שנכרת הדמיה. (ד) כיסוי של הצילום ואת עוצמת הארה של העכבר 3. הערה לוקליזציה של עוצמת האות במעי הדק. (ה) עוצמת הארה של העכבר 3. (F) כיסוי של הצילום ואת עוצמת הארה של זיוף העכבר. (G) עוצמת הארה של זיוף העכבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השיטה המתוארת כאן מאפשר, לראשונה, זיהוי וניתוח בדידה הזמני של איחוי תאים באורגניזמים, כולל חיות קטנות. הגישה משלבת Cre-LoxP רקומבינציה עם ניתוח שלאחר מכן תמונה biophotonic. הגישה ניתנת למעקב לא רק תאים תאים היתוך, אלא גם וירוס תאים היתוך ולכן יכול להיות שימושי עבור מעקב אחר זיהומים נגיפיים. ניתוח התמונה היא מהירה אפשר החיות מספר תמונות קטן בו זמנית. איתור של היתוך הוא מוגבל על ידי התדירות של היתוך של שותפים לתא מסוים microenvironments המקביל שלהם על ידי היעילות של transfection של LoxP-Stop-LoxP-בלוציפראז פלסמיד. לפיכך, תוצאות אופטימליות יושג עם שותפים היתוך המכיל טופס משולב של רצף LoxP-Stop-LoxP-בלוציפראז. בנוסף, האורגניזמים חייבים להיות נייחים לתמונה ולכן נדרשת הרדמה לבעלי חיים קטנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לד"ר Peiman Hemmati (המחלקה לרפואה, אוניברסיטת וויסקונסין) עבור בנדיבות מתן MSCs H1, ואת ד"ר טים האקר, ד"ר Gouqing שיר גב 'ג'יל קוך של אוניברסיטת ויסקונסין לב וכלי דם פיזיולוגיה Core Facility לביצוע ניתוחים העכבר. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע באמצעות מלגת מחקר לתארים מתקדמים על בריאן פרימן NIH R21 HL089679.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neon Transfection System Invitrogen MPK5000
Neon 100 μL Kit Invitrogen MPK10025 Contains R and E Buffer
a-MEM powder Invitrogen 12000-022
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03
B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J Jackson Laboratory 006054
Trypsin 10X Fisher Scientific MT-25-054-Cl
L-Glutamine Fisher Scientific 25030-081
D-Luciferin Caliper Life Sciences 122796
Xenogen Biophotonic Imaging System Caliper Life Sciences IVIS Spectrum
Sodium Biocarbonate Sigma-Aldrich S6014-500G
Non-essential Amino Acids Invitrogen 11140-050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bernirschke, K. K. P. Pathology of the Human Placenta. Springer. New York. (2000).
  2. Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta. J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).
  3. Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. Trophoblast deportation in human pregnancy--its relevance for pre-eclampsia. Placenta. 20, 531-539 (1999).
  4. Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia. Placenta. 21, 597-602 (2000).
  5. Ogle, B. M. Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo. FASEB. J. 18, 548-550 (2004).
  6. Nygren, J. M. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat. Med. 10, 494-501 (2004).
  7. Nygren, J. M. Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion. Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).
  8. Kutschka, I. Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts. Circulation. 114, I174-I180 (2006).
  9. Min, J. J. In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium. Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).
  10. Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice. Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).
  11. Weir, L. R. Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity. Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).
  12. Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O'Callaghan, D., Splitter, G. A. Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice. Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).
  13. Kadurugamuwa, J. L. Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice. Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).
  14. Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).
  15. Zhu, L. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).
  16. Noiseux, N. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation. Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).
  17. Ajiki, T. Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site. Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).
  18. Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).
  19. Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. Biological implications of cell fusion. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).
  20. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
Cre-P לקס גישה רקומבינציה לצורך זיהוי של Fusion Cell<em> In vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sprangers, A. J., Freeman, B. T., Kouris, N. A., Ogle, B. M. A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo. J. Vis. Exp. (59), e3581, doi:10.3791/3581 (2012).More

Sprangers, A. J., Freeman, B. T., Kouris, N. A., Ogle, B. M. A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo. J. Vis. Exp. (59), e3581, doi:10.3791/3581 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
simple hit counter