Análise Quantitativa de Migração aleatória de células usando microscopia de lapso de tempo vídeo

Summary

Este método permite a monitorização de células em tempo real e as medições quantitativas de parâmetros diferentes de células, tais como a velocidade de migração, o deslocamento, e velocidade. Ao contrário dos métodos tradicionais, esta abordagem em tempo real não se baseia em medições quantitativas de terminais de migração, em vez disso ele permite o monitoramento e cálculo dos parâmetros diferentes continuamente.

Abstract

A migração celular é um processo dinâmico, que é importante para o desenvolvimento embrionário, a reparação de tecidos, a função do sistema imunitário, e invasão tumoral ^{1, 2.} Durante a migração direccional, as células movem-se rapidamente em resposta a um sinal de quimiotáctico extracelular, ou em resposta a estímulos intrínsecas ³ fornecidos pela máquina motilidade de base. A migração aleatória ocorre quando uma célula possui direccionalidade intrínseca baixa, permitindo que as células para explorar seu ambiente local.

A migração celular é um processo complexo, na célula resposta inicial sofre polarização e estende-se saliências na direcção da migração ^2. Os métodos tradicionais para medir a migração, tais como o ensaio de migração Boyden câmara é um método fácil de medir a quimiotaxia in vitro, o que permite medir a migração como um resultado de ponto final. No entanto, esta abordagem não permite a medição de parâmetros de migração individuais, nem permite a visualização de alterações morfológicas que celular durante a migração.

Aqui, apresentamos um método que nos permite monitorar as células migram em tempo real usando o vídeo - microscopia de lapso de tempo. Desde a migração celular ea invasão são marcas registradas de câncer, este método será aplicado no estudo da migração de células cancerosas e invasão in vitro. A migração aleatória de plaquetas tem sido considerada como um dos parâmetros de ⁴ a função das plaquetas, por conseguinte, este método pode também ser útil no estudo da função plaquetária. Este ensaio tem a vantagem de ser rápida, fiável e reprodutível, e não necessita de optimização de números de células. A fim de manter as condições fisiologicamente adequados para as células, o microscópio é equipado com CO fornecimento ₂ e termostato temperatura. O movimento celular é monitorizada por tirar fotografias com uma câmara montada no microscópio em intervalos regulares. A migração celular pode ser calculado medindo a velocidade média e umdeslocamento MÉDIO, que é calculado pelo software Slidebook.

Protocol

1. Preparação da placa revestida com colágeno

1. Diluir colagénio para uma concentração final de 10 ug / ml em OPTI-MEM meios de comunicação.
2. Casaco 6 placas de poços com colagénio, pela adição de 1,5 ml a partir do passo 1 a cada poço. Incubar durante a noite a 4 ° C.
3. No dia seguinte, lavar a placa 2 vezes com fosfato 1x salino tamponado (PBS) e armazená-los em PBS.

2. Preparação de células e Sementeira em uma placa de 6 poços

Nota: Use a mídia quentes e PBS para garantir condições óptimas para a movimentação das células

1. Crescer MDA-MB-231 (uma linha de células de mama invasivo do cancro) escassamente em Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS). Neste exemplo, usamos o MDA-MB-231, no entanto, este método pode ser aplicado a qualquer aderentes cancerosas e não linhas de células cancerígenas.
2. Lave as células duas vezes com PBS 1x quente e recolher por tripsinização. Confira as células sob um microscópio para fazer sure que as células são adequadamente separação por tratamento com tripsina.
3. Recolher as células por adição de meio DMEM com 10% de FBS, suavemente girar para baixo as células a 1000 g durante 5 minutos. Ressuspender o sedimento de células suavemente em meio DMEM com FBS 10%.
4. Quebre o pellet celular pipetando cima e para baixo com cuidado. É importante para quebrar agrupamentos de células em células individuais, tanto quanto possível.
5. Contar as células e diluir até uma concentração final de 50.000 células / ml em meio DMEM com FBS 10%. Pipetar 2 ml em cada poço.
6. Incubar a placa a 37 ° C em um incubador de cultura de tecidos durante a noite, até começar a microscopia de lapso de tempo.
7. Para assegurar um amplo espaço para a migração, criar uma ferida utilizando uma ponta de pipeta, lavar a placa com 1X PBS para remover os restos (formado como resultado da ferida) e adicionar DMEM com FBS 10%. Verificar sob o microscópio para células flutuantes. Se um grande número de células são flutuantes, repita o procedimento de lavagem. Agora, o prato está pronto para ser configurado nomicroscópio para aquisição de imagem.

3. Instalação de microscópio e de aquisição de imagens automatizado

Existem pacotes de imagem diversos softwares que controlam o microscópio para aquisição automática de imagem. Aqui, usamos Slidebook 5,0 software de imagem automáticos e aquisições são realizadas em um microscópio Olympus (Olympus IX81), acoplado a uma câmera C9100 EM-Hamamatsu, que é excelente para aplicações em células vivas, onde a velocidade de aquisição e fototoxicidade mínima é obrigatória. O sistema inclui um estágio de câmara de controle ambiental superior (Neue Live Cell) e um controlador de fase automatizada XY (Antes Proscan). As imagens são adquiridos com um 10X UPLANFL Ph1/0.30 objectivo, no modo de campo claro, utilizando um intervalo de tempo definido. O protocolo seguinte descreve a aquisição de imagem.

1. Ligue o microscópio, câmara, e um aparelho de imagem ao vivo de células. Posicione a placa sobre o palco microscópico. Cobrir a placa com o meio celular Neue ao vivoambiental câmara de controlo, que está ligado com uma fonte de CO ₂ e sensores de temperatura. Ajuste o termostato a 37 ° C e _CO2 a 5%.
2. SlideBook software permite a seleção objetiva totalmente automatizado, a seleção de comprimento de onda e fácil troca entre as técnicas de campo fluorescentes e brilhantes. Para configurar diferentes parâmetros de controle de foco, aberto software SlideBook> ir para a barra de menu> controle de foco de seleção, clicando> e selecione os seguintes parâmetros:
   1. Na "caixa objectivo" definir o objetivo da seleção da janela suspensa. Note que estamos usando uma objetiva fase e ter selecionado manualmente o anel de fase apropriado no condensador. Se usando um sistema com um condensador automatizado, este será automaticamente ajustado através do programa de software. Alternativamente, se nem objetiva nem torre condensador são automatizados estes devem ser selecionados de cada manual doly.
   2. No "Filter Set" caixa:
      1. Selecione as configurações para direcionar o caminho da luz, quer ocular ou câmera da caixa suspensa para ver filtros disponíveis ("Live" para ocular ", Widefield" para a câmera em nosso sistema).
      2. Selecione o filtro apropriado para a iluminação de campo claro (no nosso set-up, esta opção é rotulado como "DIC", o que representa uma posição aberta para o caminho da luz brightfield).
      3. Selecione a fonte de luz, clicando em "Abrir brilhante" para abrir o obturador de campo claro.
3. Para visualizar a amostra sob a parte do olho, selecione o filtro de campo claro (posição "6" em nosso sistema) na torre. Depois de inicialmente visualizar a amostra através da ocular para encontrar campos apropriados e levar a amostra em foco (passos 3.2.1 a 3.2.2.3). Mova a torre de filtro para alterar o caminho de luz para a câmera para captura de imagem (posição "1" em nosso sistema).
4. A etapa automatizada permite a seleção de diferentes XY coordenaçãotes para capturar vários campos de interesse na aquisição da imagem. Em software SlideBook, vá para o controle de foco, escolha "XY", selecione posições diferentes embora a parte do olho, em seguida, clique em "set point" de bloqueio em cada local para captura de imagem (Figura 1).
5. Afinar o foco da imagem da câmera que é visto na tela. Isto pode ser conseguido por qualquer utilizando os controlos manuais no microscópio ou os controles de computador, que pode ajustar a focagem em incrementos muito mais finas.
6. Usando os controles na "Focus Controls" janela, ajustar a posição z do palco. Para melhores resultados, o foco em planos saliências celulares perto o contato com a placa.
7. Para ajudar com o foco use o controle deslizante para ajustar os tempos de exposição para a um conjunto adequado para focagem. Se múltiplas posições XY foram selecionados, ajustar o foco para cada posição individual: Sob o controle de foco> XY ponto de visita>. Nota: isto é feito para fazer ª, com certezano campo for correctamente focado para um instantâneo ideal.
8. Use o software para configurar os parâmetros da janela de captura. Em SlideBook, abra a captura, selecionando na barra de menus. Veja a Figura 2. Em seguida, verifique os seguintes parâmetros.
   1. Verifique Capture> tipo de lapso de tempo.
   2. Verifique conjunto de filtro: campo largo: DIC (para a imagem de campo claro).
   3. "Captura lapso de tempo" é o número de pontos de tempo que será capturada (que pode variar, dependendo do tipo de célula). Duração é o comprimento total de tempo para a experiência. Unidades de tempo [em milissegundos (ms), segundos (s), minutos (m) ou horas (h)] pode ser selecionado no menu suspenso.
   4. "Intervalo" é o atraso entre o início de um instante e no início do instante seguinte. Conforme você digita em dois desses valores, o terceiro campo será calculado automaticamente.
   5. Captura XY múltipla: selecionar "multilista de pontos "para mais de 1 posição XY.
   6. Nomeie o arquivo. No exemplo dado, temos chamado-lo '231 '.
9. Para evitar o inesperado desligar do computador devido a várias imagens, use a opção "spool" para salvar o arquivo. É opcional, porém é altamente recomendável. Para este fim, sob captura contro l> selecione Avançado> Spool> Capturar a memória e guardar no arquivo de spool após cada momentos. Navegue até o local para salvar o arquivo do livro slide (Figura 3). O filme gerado pode ser importado depois do local designado. Passos de configuração microscópio foi resumido em arquivo de 3,1 .

4. Processamento de Imagens e de Análise da Migração: Cálculo da Velocidade e Deslocamento

Neste exemplo, o processamento de imagem é feito por SlideBook ^{5, 6} 5,0 software. Existem vários outros programas como o ImageJ ⁷ para o processamento e análise de imagem.

1. Importe os arquivos SlideBook gerados a partir de imagens de campos diferentes em momentos diferentes. Vá para a barra de menu> em Image> Import> livro de slides carretel> selecione o arquivo desejado (Figura 4a).
2. Aqui nosso objetivo é rastrear o movimento de células individuais. Isso pode ser feito usando o acompanhamento automático ou acompanhamento individual. No exemplo, utilizou-se de controle manual, uma vez que isto facilita a afastar artefactos facilmente, o que é mais difícil com acompanhamento automatizado.
3. Abra o arquivo SlideBook, em que temos para realizar monitoramento. Sob o menu: Máscara Select> Protocolo de rastreamento de partículas> Protocolo de Partículas manual de Rastreamento (Figura 4b). Uma janela aparecerá com pontos de início e fim do tempo (Figura 4c).
4. Begin para controlar o movimento de células individuais, clicando no centro de cada célula (núcleo). Rastrear cerca de 10 células de cada filme e pelo menos três filmes diferentes devem ser seleccionados a partir de localizações diferentes, de modo que aproximadamente 30 células será analisado a partir de uma experiência. Cada experiência deve ser repetido três vezes. Para permitir uma abordagem imparcial, selecione as células a partir de locais diferentes, como algumas células de frente, meio, etc cantos Clique em "OK", uma vez rastreamento é feito.
5. A migração aleatória pode ser analisado através da medição mudanças etc velocidade, velocidade ou deslocamento Para analisar os dados, em Menu> máscara select> de rastreamento de partículas> protocolo de rastreamento de partículas. Seleccionar os parâmetros de controle, como descrito, a seguir: (Figura 5a):
   1. Acompanhe com - Selecione o parâmetro que você deseja monitorar na lista suspensa. Neste exemplo, utilizou-se Center, de Área (as coordenadas do centro do Object).
   2. Clique em "acompanhar e continuar". Depois de monitoramento é completo, isto irá avançar automaticamente para a próxima etapa.
6. Escolha estatísticas desejadas para cada caminho, tais como o deslocamento ea velocidade média (ver Figura 5b):
   1. Velocidade Média - a distância total percorrida dividida pelo tempo necessário para percorrer essa distância.
   2. Cilindrada total - a distância total percorrida pelo objeto.
   3. Clique em "Calcular e Continuar" se quiser avançar para a próxima etapa, ou simplesmente escolha "Calcular" se você quiser ver as estatísticas, sem passar para a próxima etapa. Um arquivo será gerado que pode ser salvo como arquivo de texto e podem ser posteriormente exportados para o Excel.
7. A fim de rastrear objetos usando o protocolo de monitoramento automatizado, primeiro uma máscara tem que ser criado.
   1. Selecione Mask> Imagem Segmento> uma janela segmento parece> selecione até limite for alcançado tal que setembroarating um objeto a partir de outros> clique em Aplicar> OK (veja a Figura 5c). Passo 4.5.1 é o mesmo.
   2. Remover Objectos menor do que - Marque esta caixa para remover seletivamente objetos menores que um determinado tamanho. Digite o tamanho no campo de edição e escolha microns ou pixels como unidade. Isto é usado para remover artefatos freqüentemente causadas por detritos.
   3. Movimento mínimo - introduzir o número mínimo de pontos de tempo que deve ser controlado a fim de determinar um caminho.
   4. Movimento máximo - Digite o movimento máximo que você espera de um determinado objeto de um ponto de tempo para o próximo.
   5. Passos para analisar os dados são os mesmos que o rastreamento manual (ver os passos para 4.5.2 4.6.2).

5. Os resultados representativos

Um exemplo de uma análise de migração aleatória como quantificada em termos de velocidade e de deslocamento (Figura 6). Depois de exportar o arquivo de to excel, os dados são plotados usando uma caixa e enredo bigodes. A análise estatística comparando o deslocamento total e velocidade média entre teste e de controlo é realizada usando teste de Mann-Whitney. A amostra de teste mostra um aumento na velocidade média, em comparação com o controle. A amostra de teste mostra um aumento no deslocamento total, em comparação com o controle.

Filme de controlo e de teste: Controle MDA-MB-231 e teste de MDA-MB-231 foram semeadas em células de colagénio durante a noite. Lapso de tempo microscopia de vídeo foi realizada por microscópio Olympus, acoplado a uma câmara EM-Hamamatsu. As imagens são tomadas a intervalos de 1 hora para um total de 18 horas durante a migração aleatória. Por favor, veja Filme 1 e Filme 2 da migração aleatória de controle e amostras de teste.

Configuração do microscópio:

Figura 1. Configurando múltiplos pontos para a imagem capturar.

Figura 2. Passos retratando controle de captura. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 3. Como salvar várias imagens.

dflinebreak "> Processamento de imagem e análise de migração.

Figura 4a. Etapas para importar imagens para análise de dados.

Figura 4B. Passos para analisar os dados usando o protocolo de trajetórias de partículas.

Figura 4c. Janela de comprimento caminho que descreve de partículas controladas.

Passos da análise de dados.

Figura 5a. Passos retratando parâmetros do protocolo de rastreamento de partículas.

Figura 5b. Selecção de estatísticas de caminho a ser analisado.

Figura 5c. Passos para criar a máscara para o protocolo de monitoramento automatizado.

A Figura 6 velocidade. Médio (Figura6a) e deslocamento (Figura 6b) é plotado em um gráfico de bigodes. A amostra de teste mostra um aumento da velocidade e do deslocamento como comparar a controlar.

Filmes

Filme 1. A migração de células de controle. Clique aqui para ver o filme .

Filme 2. A migração de células de teste. Clique aqui para ver o filme .

Controlo MDA-MB-231 e teste de MDA-MB-231 foram semeadas células de baixa densidade em colagénio para durante a noite. Lapso de tempo microscopia de vídeo foi realizada por microscópio Olympus, acoplado a uma câmara EM-Hamamatsu. As imagens são tomadas a intervalos de 1 hora durante 18 horas durante a migração aleatória. Por favor, veja os filmes da migração aleatória de controle e teste.

Discussion

O tempo real ensaio de migração aleatória permite precisas, a análise, sensível dos parâmetros celulares tais como a velocidade de migração e deslocamento. Este método não é restrita ao fim valor da medição do ponto, por isso é mais quantitativa. Uma vez que, as células são monitorizados em meio DMEM com soro normal de, que reduz o efeito deletério de incubação mais longo em soro meios livres. Tem sido demonstrado que a migração de células depende da formatação e quebrando contactos celulares com o substrato ^8, assim, este método pode ser usado para estudar o efeito de diferentes substratos sobre a migração.

Um dos passos críticos envolve o controlo adequado de temperatura para 37 ° C e _CO2 a 5% para assegurar a migração óptimo. O ensaio permite flexibilidade para monitorizar respostas migratórias em pontos de tempo desejados, no entanto, pode exigir a optimização do número de pontos de tempo. Por exemplo, algumas células que têm menores taxas de migração pode ter que ser monitorizada por um eistempo nger, em comparação com células que possuem taxas mais elevadas de migração.

O microambiente do tumor é um dos factores cruciais na carcinogénese. Resultados do cancro da interacção das células tumorais com as células vizinhas, tais como células endoteliais, estromais e células inflamatórias ^9. Este ensaio pode ser modificado para estudar como a migração de células de tumor são influenciados pelo microambiente. Uma das maneiras pelas quais isto pode ser conseguido é através do estudo da migração de células tumorais marcadas por fluorescência cultivadas em uma população mista de células diferentes, tais como células estoma e endotelial. Este método também pode ser usado para estudar a cicatrização de feridas em tempo real.

Time-lapse microscopia poderia ser modificado para controlar a invasão de células, a divisão celular, a apoptose ea dinâmica lamellipodial e dinâmicas de adesão focal usando lentes de alta resolução.

Uma das limitações deste método é que ele não permite monitorização de migraçãoção in vivo. Uma vez que não há nenhum equipamento disponível que pode medir a migração em tempo real no corpo, este tipo de ensaio não é adequado para a migração in vivo. Também não permitem elucidar o mecanismo bioquímico e componentes de sinalização que são importantes na migração celular. A fim de resolver as vias de sinalização, é essencial para realizar experiências bioquímicas. Veja as referências para os grupos que usaram este método para migração aleatória ^{6, 10-14.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30243.01
FBS	Gemini Bio Products	100-106
Opti-Mem	Invitrogen	31985-070
Collagen	BD Biosciences	354231
Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller	Olympus Corporation	Olympus 1X81
Environmental control chamber	Neue	Neue Live Cell Chamber	Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments.
Automated XY stage	Prior Scientific	Prior Proscan	This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy.
Camera		Hamamatsu EM camera C9100
Software	Typically purchased through microscope vendor such as Olympus	Slide Book 5