Summary
Questo metodo permette di monitoraggio delle cellule in tempo reale e misurazioni quantitative dei diversi parametri di migrazione cellulare, quali la velocità, spostamento e velocità. A differenza dei metodi tradizionali, questo approccio in tempo reale non si basa su misurazioni quantitative di migrazione degli endpoint, invece permette di monitorare e calcolare diversi parametri in modo continuo.
Abstract
La migrazione delle cellule è un processo dinamico, che è importante per lo sviluppo embrionale, la riparazione dei tessuti, la funzione del sistema immunitario, e l'invasione tumorale 1, 2. Durante la migrazione direzionale, cellule muoversi rapidamente in risposta ad un segnale extracellulare chemiotattica, o in risposta a stimoli intrinseci 3 forniti dalla macchina motilità di base. Migrazione casuale si verifica quando una cellula possiede bassa direzionalità intrinseca, permettendo alle cellule di esplorare il loro ambiente locale.
La migrazione cellulare è un processo complesso, nella cella risposta iniziale subisce polarizzazione e sporgenze si estende nella direzione di migrazione 2. I metodi tradizionali per misurare la migrazione quale il saggio Boyden camera di migrazione è un metodo semplice per misurare chemiotassi in vitro, che consente di misurare la migrazione come risultato punto finale. Tuttavia, questo approccio non permette la misurazione di parametri di migrazione singoli, né permette di Visuazazione dei cambiamenti morfologici delle cellule subisce durante la migrazione.
Qui vi presentiamo un metodo che ci permette di monitorare le cellule che migrano in tempo reale con video - microscopia lasso di tempo. Poiché la migrazione cellulare e dell'invasione sono le caratteristiche di cancro, questo metodo è applicabile a studiare la migrazione delle cellule del cancro e l'invasione in vitro. Migrazione casuale di piastrine è stato considerato come uno dei parametri di funzionalità piastrinica 4, quindi questo metodo potrebbe anche essere utile nello studio funzioni piastriniche. Questo saggio ha il vantaggio di essere rapida, affidabile, riproducibile, e non richiede l'ottimizzazione del numero di cellule. Al fine di mantenere condizioni fisiologicamente adatte cellule, il microscopio è dotato di CO 2 di alimentazione e termostato. Movimento cellulare viene monitorata da ripresa di immagini con una telecamera montata sul microscopio a intervalli regolari. La migrazione cellulare può essere calcolata misurando la velocità media eMEDIO spostamento, che viene calcolato dal software Slidebook.
Protocol
1. Preparazione della piastra ricoperta di collagene
- Diluire collagene ad una concentrazione finale di 10 pg / ml in Opti-Mem media.
- Ricoprire piastre da 6 pozzetti con collagene, con l'aggiunta di 1,5 ml dal passaggio 1 a ciascun pozzetto. Incubare per una notte a 4 ° C.
- Il giorno seguente, lavare la piastra 2 volte con 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) e memorizzarli in PBS.
2. Preparazione cellulare e Semina su una piastra da 6 pozzetti
Nota: Utilizzare i media caldi e PBS per garantire condizioni ottimali per il movimento delle cellule
- Grow MDA-MB-231 (uno carcinoma invasivo della mammella linea cellulare) scarsamente in Dulbeccòs Modified Eaglès Medium (DMEM) con 10% siero fetale bovino (FBS). In questo esempio, si usa il MDA-MB-231, tuttavia, questo metodo può essere applicato a qualsiasi aderenti linee tumorali e non di cellule cancerose.
- Lavare le cellule due volte con PBS 1x caldo e raccogliere per tripsinizzazione. Controllare cellule sotto il microscopio per fare sunuovamente che le cellule siano staccate con trattamento con tripsina.
- Raccogliere le cellule aggiungendo mezzo DMEM con 10% FBS, dolcemente centrifugare le cellule a 1000 g per 5 minuti. Risospendere il pellet di cellule delicatamente in mezzo con DMEM 10% FBS.
- Rompere il pellet di cellule pipettando su e giù delicatamente. È importante per abbattere cluster cellulari in singole celle per quanto possibile.
- Contare le cellule e diluire ad una concentrazione finale di 50.000 cellule / ml in DMEM media con 10% FBS. Dispensare 2 ml in ciascun pozzetto.
- Incubare la piastra a 37 ° C in un incubatore di coltura tissutale notte, fino a partire il time-lapse microscopia.
- Per assicurare un ampio spazio per la migrazione, crea una ferita utilizzando una punta di pipetta, lavare la piastra con 1X PBS per rimuovere i detriti (formata come risultato di ferita) ed aggiungere DMEM con 10% FBS. Controllare sotto il microscopio di cellule galleggianti. Se un gran numero di cellule sono flottanti, ripetere la procedura di lavaggio. Ora, la lastra è pronta per essere configurato sulmicroscopio per l'acquisizione dell'immagine.
3. Microscopio di installazione e acquisizione di immagini automatica
Ci sono diversi pacchetti software di imaging che controllano il microscopio per l'acquisizione automatica di immagini. Qui, usiamo Slidebook 5,0 software di imaging e acquisizioni automatici vengono eseguiti con un microscopio Olympus (Olympus IX81), accoppiato ad un EM-telecamera Hamamatsu C9100, che è eccellente per le applicazioni live-cella in cui la velocità di acquisizione e la fototossicità minima è di primaria importanza. Il sistema comprende un top camera di controllo ambientale, stage (Neue Live Cell) e un sistema automatico di controllo stadio XY (Prior Proscan). Le immagini vengono acquisite con un 10X UPLANFL Ph1/0.30 obiettivo, in modalità campo chiaro, con un intervallo di tempo definito. Il protocollo che segue descrive l'acquisizione dell'immagine.
- Accendere il microscopio, macchina fotografica, e live apparecchio imaging cellulare. Posizionare la piastra sopra il palco microscopico. Coprire la piastra da ENVI Neue Live Cellambientale camera di controllo, che è collegato con un rifornimento di CO 2 e sensori di temperatura. Regolare il termostato a 37 ° C e CO 2 al 5%.
- SlideBook software consente la selezione oggettiva completamente automatizzato, la selezione lunghezza d'onda e di passare facilmente tra le tecniche di campo e luminose fluorescenti. Al fine di impostare diversi parametri di controllo messa a fuoco, il software open SlideBook> vai alla barra dei menu di controllo messa a fuoco> selezionare, cliccando>
e selezionare i parametri seguenti: - Nella "scatola Obiettivo," definire l'obiettivo a scelta, finestra a discesa. Si noti che stiamo usando un obiettivo di fase e hanno selezionato manualmente l'anello appropriato fase nel condensatore. Se si utilizza un sistema con un condensatore automatizzata, questa verrà automaticamente impostato attraverso il programma software. In alternativa, se non torretta obiettivo, né condensatore sono automatizzati questi dovrebbero essere selezionati ogni manualely.
- Nel campo "Filter Set" box:
- Selezionare le impostazioni di orientare il percorso della luce né al oculare o la fotocamera dal menu a tendina per visualizzare i filtri disponibili ("Live" per oculare, "widefield" per la Camera nel nostro sistema).
- Selezionare il filtro appropriato per brightfield illuminazione (nel nostro set up, questa opzione è etichettato come "CID", che rappresenta una posizione aperta per il percorso della luce campo chiaro).
- Selezionare la sorgente di luce facendo clic su "Apri Luminoso" per aprire l'otturatore più luminosa.
- Per visualizzare l'esempio sotto l'oculare, selezionare il filtro più luminosa (posizione "6" nel nostro sistema) sulla torretta. Dopo aver inizialmente la visualizzazione del campione attraverso l'oculare di trovare campi appropriati e portare il campione a fuoco (punti da 3.2.1 a 3.2.2.3). Spostare la torretta filtro per modificare il percorso della luce per la fotocamera per l'acquisizione di immagini (posizione "1" nel nostro sistema).
- La fase automatizzata consente la selezione di diversi XY coordinamentotes per catturare più campi di interesse durante l'acquisizione dell'immagine. Nel software SlideBook, passa al controllo di messa a fuoco, selezionare "XY", selezionare diverse posizioni anche se il pezzo occhio, quindi fare clic su "set point" lock in ogni luogo per l'acquisizione di immagini (Figura 1).
- Affinare la messa a fuoco dell'immagine della telecamera che viene visualizzato sullo schermo. Ciò può essere realizzato o utilizzando i comandi manuali del microscopio o controlli di computer, che può regolare la messa in incrementi più sottili.
- Utilizzando i controlli nella "Focus Controls" finestra, regolare la posizione z del palcoscenico. Per ottenere risultati ottimali, concentrarsi su piani sporgenze cellulari vicino al contatto con la piastra.
- Per aiutare con messa a fuoco utilizzare il cursore per regolare i tempi di esposizione di essere in una gamma appropriata per la messa a fuoco. Se più posizioni XY sono state selezionate, regolare la messa a fuoco per ogni posizione individuale: Sotto il controllo di messa a fuoco> XY visita> punto. Nota: questo viene fatto per assicurarsi che, tha campi sono correttamente focalizzata per una istantanea ottimale.
- Utilizzare il software per impostare i parametri della finestra di acquisizione. In SlideBook, aprire la cattura selezionando
dalla barra dei menu. Vedere la Figura 2. Abbiamo quindi i seguenti parametri. - Controllare Capture> tipo lasso di tempo.
- Controllo del filtro del set: Wide field: DIC (per l'immagine in campo chiaro).
- "Lapse Time" è il numero di punti temporali che verrà acquisita (può variare, a seconda del tipo di cellula). La durata è la lunghezza totale del tempo per l'esperimento. [Unità di tempo in millisecondi (ms), secondi (s), minuti (m) o ore (h)] può essere selezionato dal menu a discesa.
- "Interval" è il ritardo tra l'inizio di un tempo di valutazione e l'inizio del successivo tempo di valutazione. Come si digita in due di questi valori, il terzo campo viene calcolato automaticamente.
- XY cattura multipla: selezionare "multiPunto di lista "per più di 1 posizione XY.
- Assegnare un nome al file. Nell'esempio riportato, lo abbiamo chiamato '231 '.
- Per evitare imprevisti spegnere del computer a causa di immagini multiple, utilizzare l'opzione "spool" per salvare il file. E 'facoltativo, ma è altamente consigliato. A tale scopo, sotto la cattura Contro l> selezionare Avanzate> Spool> Cattura alla memoria e salvare file di spool dopo ogni punti temporali. Sfoglia il percorso in cui salvare il file del libro slitta (Figura 3). Il filmato generato può essere importato successivamente dal luogo designato. Passi di installazione microscopio è stato riassunto in file di 3,1 .
e selezionare i parametri seguenti: 
dalla barra dei menu. Vedere la Figura 2. Abbiamo quindi i seguenti parametri. 4. Image Processing e analisi della migrazione: Calcolo della velocità e spostamento
In questo esempio, l'elaborazione delle immagini viene fatto SlideBook 5, 6 5,0 software. Ci sono vari altri programmi, come ImageJ 7 per l'elaborazione delle immagini e analisi.
- SlideBook importare i file generati da immagini di campi diversi in momenti diversi. Vai alla barra dei menu> sotto Immagine> Importa> Presentazione libro di spool> selezionare il file desiderato (Figura 4a).
- Qui il nostro obiettivo è quello di tracciare il movimento delle singole cellule. Esso può essere fatto utilizzando il monitoraggio automatizzato o inseguimento individuale. In questo esempio, abbiamo usato tracciamento manuale, dal momento che questo agevola escludere artefatti facilmente, che è più difficile con il monitoraggio automatizzato.
- Aprire il file SlideBook, in cui dobbiamo effettuare tracking. In menu: Maschera Seleziona> Monitoraggio protocollo Particle protocollo Particle> Manuale di monitoraggio (Figura 4b). Apparirà una finestra con i punti di inizio e la fine (Fig. 4c).
- Begin per seguire il movimento di cellule individuali cliccando il centro di ciascuna cella (nucleo). Traccia circa 10 cellule di ogni film e almeno tre film diversi dovrebbero essere selezionati da diverse posizioni in modo che circa 30 cellule saranno analizzate da un esperimento. Ogni esperimento deve essere ripetuta tre volte. Per consentire un approccio imparziale, selezionare le celle da posizioni diverse, come alcune cellule dalla parte anteriore, centrale, ecc angoli Fare clic su "OK", una volta che il monitoraggio è fatto.
- Migrazione casuale può essere analizzata misurando i cambiamenti nella velocità e così via, velocità o spostamento Per analizzare i dati, in Menu> maschera selezionare> tracciamento di particelle> protocollo di monitoraggio di particelle. Selezionare i parametri di monitoraggio come descritto, di seguito: (figura 5a):
- Pista con - Selezionare il parametro che si desidera tenere traccia dal menu a tendina. In questo esempio, abbiamo usato, centro della zona (le coordinate del centro della Obgetto).
- Fare clic su "traccia e continua". Una volta che il monitoraggio è completo, questo passa automaticamente alla fase successiva.
- Scegli le statistiche desiderate per ciascun percorso, come lo spostamento e la velocità media (vedi figura 5b):
- Velocità media - la distanza totale percorsa divisa per il tempo necessario per percorrere quella distanza.
- Cilindrata totale - la distanza totale percorsa dall'oggetto.
- Fare clic su "Calcola e continua" se si desidera passare al passo successivo, o semplicemente selezionare "Calcola" se si desidera visualizzare le statistiche senza passare alla fase successiva. Un file che verrà generato può essere salvato come file di testo e possono poi essere esportati in Excel.
- Al fine di tenere traccia degli oggetti che utilizzano il protocollo automatizzato di monitoraggio, in primo luogo una maschera deve essere creato.
- Selezionare Maschera Segment> Immagine> una finestra segmento sembrerebbe> selezionare fino a quando si raggiunge la soglia in modo tale che settembrearating un oggetto da altri> fare clic su Applica> OK (vedi Figura 5c). Fase 4.5.1 è la stessa.
- Rimuovere gli oggetti più piccoli - Selezionare questa casella per rimuovere selettivamente gli oggetti più piccolo di una certa dimensione. Inserire la dimensione del campo di modifica e scegliere micron o pixel come unità. Questo viene utilizzato per rimuovere artefatti spesso causati da detriti.
- Movimento minimo - immettere il numero minimo di punti temporali che devono essere monitorati per determinare un percorso.
- Massimo movimento - Inserire il movimento massimo che ci si aspetta da un dato oggetto da un punto temporale a quello successivo.
- Procedura per analizzare i dati sono gli stessi di tracciamento manuale (vedere la procedura 4.5.2 a 4.6.2).
5. Risultati rappresentativi
Un esempio di analisi migrazione casuale quantificata in termini di velocità e di spostamento (Figura 6). Dopo aver esportato il file di to excel, i dati vengono stampati utilizzando una scatola e la trama baffi. Analisi statistica confronto spostamento totale e la velocità media tra prova e di controllo viene eseguita utilizzando Mann-Whitney. Il campione di prova mostra un aumento della velocità media rispetto al controllo. Il campione di prova mostra un aumento di cilindrata totale rispetto al controllo.
Film di controllo e di prova: controllo MDA-MB-231 e test di MDA-MB-231 cellule sono state seminate su collagene notte. Time-lapse video di microscopia è stata eseguita al microscopio Olympus, accoppiato ad un EM-Hamamatsu fotocamera. Le immagini sono prese in un intervallo di 1 ora per un totale di 18 ore durante la migrazione casuale. Vedere Movie Movie 1 e 2 della migrazione casuale per il controllo e campioni di prova.
Microscopio setup:
Figura 1. Costituzione di punti di più per l'immagine catturare.
Figura 2. Piazza raffiguranti il controllo di cattura. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Come salvare più immagini.
dflinebreak "> Elaborazione di immagini e l'analisi della migrazione.
Figura 4A. Passi per importare l'immagine per l'analisi dei dati.
Figura 4b. Fasi per analizzare i dati utilizzando il protocollo di monitoraggio di particelle.
Figura 4c. Lunghezza del percorso delle particelle Window raffigurante cingolati.
Passi di analisi dei dati.
Figura 5a. Passi che raffigurano i parametri del protocollo di monitoraggio di particelle.
Figura 5b. Selezione di statistiche percorso da analizzare.
Figura 5c. I passaggi per creare la maschera per il protocollo di monitoraggio automatizzato.
Figura 6. Velocità media (Figura6a) e lo spostamento (figura 6b) è tracciata in una trama baffi. Il campione di prova mostra un aumento di velocità e spostamento come confronto al controllo.
Film
Movie 1. La migrazione di cellule di controllo. Clicca qui per visualizzare il filmato .
Movie 2. La migrazione delle cellule di prova. Clicca qui per visualizzare il filmato .
Controllo MDA-MB-231 e test di MDA-MB-231 cellule sono state seminate su scarsamente collagene per una notte. Time-lapse video di microscopia è stata eseguita al microscopio Olympus, accoppiato ad un EM-Hamamatsu fotocamera. Le immagini sono prese in un intervallo di 1 ora per 18 ore durante la migrazione casuale. Si prega di vedere i film della migrazione casuale per il controllo e test.
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Discussion
Il vero test di migrazione tempo casuale consente di preciso, sensibile, l'analisi dei parametri di migrazione delle cellule come la velocità e spostamento. Questo metodo non è limitato alla fine misura valore punto, quindi è più quantitativa. Dal momento che, le cellule vengono monitorati nel normale terreno DMEM con siero, ma riduce l'effetto deleterio di incubazione più lungo nel siero dei media liberi. È stato dimostrato che la migrazione delle cellule dipende dalla formattazione e rottura delle cellule contatti con il substrato 8, quindi, questo metodo può essere usato per studiare effetto di diversi substrati sulla migrazione.
Una delle fasi critiche comporta un adeguato controllo della temperatura a 37 ° C e CO 2 al 5% per garantire una migrazione ottimale. Il saggio consente flessibilità per monitorare le risposte migratorie a tempi desiderati, tuttavia, può richiedere ottimizzare il numero di punti temporali. Ad esempio, alcune cellule che hanno più bassi tassi di migrazione potrebbe essere monitorato per un longer tempo rispetto alle cellule che presentano velocità di migrazione elevati.
Il microambiente del tumore è uno dei fattori cruciali nella carcinogenesi. Cancer risultati derivanti dall'interazione delle cellule tumorali con cellule circostanti, quali cellule endoteliali, cellule stromali e infiammatorie 9. Questo dosaggio può essere modificato per studiare come la migrazione di cellule tumorali sono influenzate dal microambiente. Uno dei modi in cui può essere ottenuti è studiando la migrazione di fluorescente cellule tumorali coltivate in una popolazione mista di cellule differenti quali cellule endoteliali e stomia. Questo metodo può anche essere utilizzata per studiare la guarigione delle ferite in tempo reale.
Time-lapse microscopia potrebbe essere modificato per monitorare l'invasione delle cellule, la divisione cellulare, apoptosi e la dinamica lamellipodial e le dinamiche di adesione focali con ottiche ad alta risoluzione.
Uno dei limiti di questo metodo è che non permette il monitoraggio di migrazione in vivo. Poiché non vi è alcuna attrezzatura disponibile che può misurare la migrazione in tempo reale nel corpo, questo tipo di saggio non è adatto per la migrazione in vivo. Inoltre non ci permette di chiarire il meccanismo biochimico e componenti di segnalazione che sono importanti nella migrazione cellulare. Per affrontare le vie di segnalazione, è essenziale eseguire esperimenti biochimici. Vedi riferimenti per i gruppi che hanno utilizzato questo metodo per la migrazione casuale 6, 10-14.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Amanda Struckhoff per l'aiuto iniziale con l'esperimento. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio NIH 5RO1CA115706.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30243.01 | |
| FBS | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354231 | |
| Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus Corporation | Olympus 1X81 | |
| Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
| Automated XY stage | Prior Scientific | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
| Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
| Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |
References
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