Kvantitativ analyse af Random migration af celler Brug af Time-lapse Video Microscopy

Summary

Denne fremgangsmåde tillader overvågning af celler i realtid og kvantitative målinger af forskellige cellemigrering parametre såsom hastighed, forskydning og hastighed. I modsætning til de traditionelle metoder, er dette realtime strategi ikke er baseret på endpoint kvantitative migration målinger, i stedet giver mulighed for overvågning og beregning af forskellige parametre kontinuerligt.

Abstract

Cellemigration er en dynamisk proces, hvilket er vigtigt for embryonisk udvikling, vævsreparation, immunsystem, og tumorinvasion ^{1, 2.} Under retningsbestemt migration, bevæger celler hurtigt i respons på et ekstracellulært kemotaktisk signal, eller som reaktion på iboende signaler ^3, som det grundlæggende motilitet maskinen. Tilfældigt migration forekommer, når en celle har lav indre retningsbestemthed, således at cellerne undersøge deres lokale miljø.

Cell migration er en kompleks proces, i det første svar cellen undergår polarisering og udvider fremspring i retning af migration ^2. Traditionelle metoder til måling af migration såsom Boyden-kammer migration assay er en let metode til at måle kemotaksi in vitro, hvilket muliggør måling migration som et slutpunkt resultat. Men denne fremgangsmåde hverken tillader måling af de enkelte migration parametre, ligesom det heller ikke muligt at visuasering af morfologiske ændringer, som cellen undergår i løbet af migration.

Her præsenterer vi en metode, der giver os mulighed for at overvåge vandrende celler i realtid ved hjælp af video - tidsforskydningen mikroskopi. Siden celle migration og invasion er kendetegnende for kræft, vil denne metode kunne anvendes til at studere kræft celle migration og invasion in vitro. Tilfældig migration af blodplader er blevet betragtet som en af parametrene for trombocytfunktionen ^4, derfor denne metode kunne også være nyttigt i at studere blodplade funktioner. Dette assay har den fordel at være hurtig, pålidelig, reproducerbar og ikke kræver optimering af celleantal. For at opretholde fysiologisk egnede betingelser for celler, er mikroskop udstyret med _CO2 forsyning og temperatur termostat. Cellebevægelse overvåges ved at tage billeder ved hjælp af et kamera er monteret på mikroskop ved regelmæssige mellemrum. Cellemigration kan beregnes ved at måle den gennemsnitlige hastighed, og enGennemsnitligt forskydning, der beregnes ved Slidebook software.

Protocol

1. Udarbejdelse af plade med Collagen

1. Fortyndes collagen til en slutkoncentration på 10 ug / ml i Opti-MEM-medium.
2. Coat 6-brøndsplader med collagen, ved tilsætning af 1,5 ml fra trin 1 til hver brønd. Inkuber natten over ved 4 ° C.
3. Den følgende dag vaskes pladen 2 gange med 1X phosphatpufret saltvand (PBS) og lagrer dem i PBS.

2. Cellepræparat og podning på en 6-brønds plade

Bemærk: Brug varme medier og PBS for at sikre optimale betingelser for cellebevægelse

1. Vokser MDA-MB-231 (en invasiv brystcancer-cellelinie) tyndt i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS). I dette eksempel benytter vi MDA-MB-231, men kan denne fremgangsmåde anvendes til de adhærente cancerøse og godartet cellelinier.
2. Vask cellerne to gange med varm 1x PBS og opsamles ved trypsinisering. Se celler under et mikroskop for at sure, at cellerne er korrekt frigøres ved trypsinbehandling.
3. Indsamle cellerne ved tilsætning af DMEM medium med 10% FBS, forsigtigt vågeblus cellerne ved 1000 g i 5 minutter. Resuspender cellepelleten forsigtigt i DMEM-medium med 10% FBS.
4. Bryde cellepelleten ved at pipettere op og ned forsigtigt. Det er vigtigt at nedbryde celleklynger i individuelle celler så meget som muligt.
5. Tæl cellerne og fortyndes til en slutkoncentration på 50.000 celler / ml i DMEM medier med 10% FBS. Dispensere 2 ml i hver brønd.
6. Inkubér pladen ved 37 ° C i en vævskultur-inkubator natten over, indtil udgangsmaterialet tid-lapse mikroskopi.
7. For at sikre god plads til migration skabe et sår ved hjælp af en pipettespids, vask pladen med 1X PBS for at fjerne debris (dannet som et resultat af sår), og der tilsættes DMEM med 10% FBS. Kontroller under mikroskop for flydende celler. Hvis et stort antal celler er flydende, gentage vask procedure. Dag, pladen er klar til at blive opsætning påmikroskop for billede erhvervelse.

3. Mikroskop Opsætning og Automatisk Image Acquisition

Der er flere billeddiagnostiske softwarepakker, der styrer mikroskopet til automatiseret billede erhvervelse. Her bruger vi Slidebook 5,0 imaging software og automatiske opkøb er foretaget på et Olympus mikroskop (Olympus IX81), koblet til en EM-Hamamatsu C9100 kamera, som er fremragende til live-cell applikationer, hvor hastigheden af ​​køb og minimal fototoksicitet er altafgørende. Systemet indbefatter et trin top miljømæssig styrekammeret (Neue levende celler) og en automatiseret XY-scene styreenhed (kendt ProScan). Billeder er erhvervet med en 10X UPLANFL Ph1/0.30 mål, lyse felt tilstand, ved hjælp af et defineret tidsinterval. Følgende protokol beskriver billedet købet.

1. Tænd mikroskopet, kamera, og live cell imaging apparatur. Placer pladen over mikroskopiske scenen. Dæk pladen med Neue Live-Cell miljømæssig styrekammer, som er forbundet med en CO ₂ forsyning og temperatursensorer. Indstilles på 37 ° C og CO ₂ til 5%.
2. SlideBook software giver mulighed for fuldautomatisk objektiv udvælgelse, bølgelængde udvælgelse og nemt at skifte mellem lysstofrør og lyse felt teknikker. For at oprette forskellige parametre i fokus kontrol, åben SlideBook software> gå til menulinjen> vælg fokus kontrol, ved at klikke på> og vælge følgende parametre:
   1. I "mål boksen," definere mål ved valg fra drop-down vinduet. Bemærk, at vi ved anvendelse af en fase objektiv og har manuelt valgt passende fase ringen i kondensatoren. Hvis du bruger et system med en automatiseret kondensator, vil dette automatisk via programmet. Alternativt, hvis hverken objektiv tårn eller kondensator er automatiseret disse bør hver vælges manuelly.
   2. I "Filter Set"-boksen:
      1. Vælg indstillinger for at styre lyset stien til enten okular eller kamera fra drop-down boks for at se de tilgængelige filtre ("Live" for okular, "Widefield" for kamera i vores system).
      2. Vælg det rette filter for lysfelt belysning (i vores set up, er denne indstilling mærket "DIC", som repræsenterer en åben position for lysfelt straalegangen).
      3. Vælg lyskilden ved at klikke på "Åbn Bright" for at åbne den lyse feltet lukkeren.
3. For at se prøven under øjet brik, skal du vælge lyse felt filter (position "6" i vores system) på tårnet. Efter første visning af prøven gennem okularet for at finde relevante felter og bringe prøven i fokus (trin 3.2.1 til 3.2.2.3). Flyt filter tårnet til at ændre lyset vej til kameraet for billedoptagelse (position "1" i vores system).
4. Den automatiserede trin tillader valg af forskellige XY koordinetes til at fange flere områder af interesse under billedet erhvervelse. I SlideBook software, at fokus kontrol går, vælg "XY", skal du vælge forskellige positioner selvom øjet brik, og klik derefter på "set point" lås i hver lokation for billedoptagelse (figur 1).
5. Finjuster fokus for kameraet billedet, som vises på skærmen. Dette kan opnås ved enten at anvende de manuelle kontroller på mikroskop eller styrer computeren, som kan justere fokus for meget finere trin.
6. Brug af kontroller i "Focus Controls" vinduet, justere Z position på scenen. For de bedste resultater, fokusere på flade cellulære fremspring tæt kontakt med pladen.
7. For at hjælpe med at fokusere bruge skyderen til at justere eksponering gange for at være i et passende antal til at fokusere. Hvis flere XY der er valgt, justere fokus for hver enkelt position: Under fokuskontrol> XY> besøg punkt. Bemærk: dette gøres for at sikre, thpå felter er korrekt fokuseret for en optimal snapshot.
8. Brug software til at konfigurere fange vindue parametre. I SlideBook, åbne capture ved at vælge menulinjen. Se figur 2. Vi derefter kontrollere følgende parametre.
   1. Check Capture type> som tidsforskydningen.
   2. Check Filter sæt: Bredt felt: DIC (for lyst felt billede).
   3. "Tidsforskydning capture" er antallet af tidspunkter, som vil blive fanget (det kan variere afhængigt af celletypen). Varighed er den samlede længde af tid til eksperimentet. Enheder af tid [i millisekunder (ms), sekunder (s), minutter (m) eller timer (h)] kan vælges fra rullemenuen.
   4. "Interval" er forsinkelsen mellem begyndelsen af ​​en tidspunkterne og begyndelsen af ​​det næste tidspunkt. Som du skriver i to af disse værdier, vil det tredje felt beregnes automatisk.
   5. Multiple XY capture: Vælg "multipunkt liste "for mere end 1 XY position.
   6. Navngiv filen. I det givne eksempel, har vi kaldte det '231 '.
9. For at undgå uventet nedlukning af computeren på grund af flere billeder, skal du bruge "spole muligheden" for at gemme filen. Det er valgfrit, men det kan varmt anbefales. Til dette formål, kontroversielle l> vælg Avanceret> Spool> Optag til hukommelse og gemme spool fil efter hver tidspunkter. Under capture Gennemse sted at gemme slide bogfil (Figur 3). Den genererede filmen kan importeres senere fra den udpegede placering. Trin mikroskop setup er opsummeret i fil 3,1 .

4. Billede bearbejdning og analyse af Migration: Beregning af hastighed og forskydning

I dette eksempel er billedbehandling gøres ved SlideBook ^{5, 6} 5.0-software. Der er forskellige andre programmer, såsom ImageJ ⁷ for billedbehandling og-analyse.

1. Importer SlideBook filer genereret fra billeder af forskellige områder på forskellige tidspunkter. Gå til menulinjen> under Image> Importer> Dias bog spole> vælge den ønskede fil (figur 4a).
2. Her er det vores mål at spore bevægelsen af ​​de enkelte celler. Det kan gøres ved hjælp af automatiseret sporing eller individuel sporing. I eksempel har vi anvendt manuel registrering, da dette letter udelukker artefakter let, hvilket er vanskeligt med automatiseret sporing.
3. Åbn SlideBook filen, hvor vi er nødt til at udføre tracking. Under menu: Vælg Mask> Particle Tracking protokollen> Manuel Partikel Sporing Protocol (figur 4b). Et vindue vises med start og slut tidspunkter (figur 4c).
4. Begin at spore bevægelse af individuelle celler ved at klikke på midten af ​​hver celle (kerne). Spor omkring 10 celler fra hver film og mindst tre forskellige film bør udvælges fra forskellige steder, således at cirka 30 celler vil blive analyseret af et eksperiment. Hvert eksperiment gentages tre gange. For at muliggøre en fordomsfri tilgang, skal du markere celler fra forskellige steder såsom nogle celler fra front-, middle, hjørner osv. Klik på "OK", når tracking sker.
5. Tilfældig migration kan analyseres ved at måle ændringer i hastighed, hastighed eller forskydning osv. at analysere de data, under menu> vælg maske> partikel sporing> partikel sporing protokol. Vælge sporingsparametre som beskrevet nedenfor: (figur 5a):
   1. Spor med - Vælg den parameter, du ønsker at spore fra dropdown listen. I dette eksempel har vi anvendt Center område (koordinaterne af centret af OBtet).
   2. Klik på "spore og fortsætte". Når sporing er færdig, vil dette automatisk videre til næste trin.
6. Vælg den ønskede statistik for hver bane, såsom forskydning og den gennemsnitlige hastighed (se figur 5b):
   1. Gennemsnitlig Speed ​​- den samlede distance divideret med tid, der kræves til at rejse denne afstand.
   2. Total Displacement - den samlede distance af objektet.
   3. Klik på "Beregn og fortsæt", hvis du ønsker at gå videre til næste trin, eller blot vælge "Beregn" hvis du ønsker at se dine statistikker uden at gå til næste trin. En fil vil blive genereret, som kan gemmes som tekst-fil og kan senere eksporteres til Excel.
7. For at spore objekter ved hjælp af automatisk sporing protokol, først en maske skal oprettes.
   1. Vælg Mask> Segment Billede> et segment vindue synes> vælge, indtil tærsklen er nået sådan, at septemberarating en objekt fra andre> klik Anvend> OK (se figur 5c). Trin 4.5.1, er den samme.
   2. Fjerne objekter er mindre end - Afkryds dette felt til selektivt at fjerne objekter mindre end en given størrelse. Indtast størrelse i feltet og vælg enten mikron eller pixels, som enheden. Dette bruges til at fjerne artifakter hyppigt forårsaget af urenheder.
   3. Mindst bevægelse - angive det mindste antal tidspunkter, der skal spores for at bestemme en kurve.
   4. Maksimal bevægelse - Indtast det maksimale bevægelse, du forventer fra en given genstand fra et tidspunkt til det næste.
   5. Skridt til at analysere de data, er de samme som manuel sporing (se trinene 4.5.2 til 4.6.2).

5. Repræsentative resultater

Et eksempel på en tilfældig migrationsanalyse som kvantificeret med hensyn til hastighed og forskydning (fig. 6). Efter at eksportere filen to excel, er afbildede data ved hjælp af en æske og whiskers plot. Statistisk analyse, der sammenligner samlede forskydning og den gennemsnitlige hastighed mellem test og kontrol udføres ved anvendelse af Mann-Whitney test. Prøven viser en stigning i den gennemsnitlige hastighed sammenlignet med kontrollen. Prøven viser en stigning i samlet forskydning sammenlignet med kontrollen.

Film af kontrol-og prøve: Kontrol MDA-MB-231 og test MDA-MB-231 celler blev podet på collagen natten over. Time-lapse video mikroskopi blev udført ved Olympus mikroskop, der er koblet til en EM-Hamamatsu kamera. Billeder taget med et interval på 1 time i alt 18 timer under tilfældig migrering. Se venligst Movie 1 og Movie 2 af tilfældig migration for kontrol og prøver.

Microscope opsætning:

Figur 1. Opsætning af flere punkter til billeder fange.

Figur 2. Trin skildrer fange kontrol. Klik her for at se større figur .

Figur 3. Sådan sparer du flere billeder.

dflinebreak "> Billede bearbejdning og analyse af migration.

Figur 4a. Trin for at importere billeder til dataanalyse.

Figur 4b. Skridt til at analysere data ved hjælp af partikel-sporing protokol.

Figur 4c. Window viser vejlængde på sporede partikler.

Steps af dataanalyse.

Figur 5a. Trin afbilder parametre partikel sporing protokol.

Figur 5b. Valg af sti statistikker, der skal analyseres.

Figur 5c. Trin for at oprette maske til automatiseret sporing protokol.

Figur 6. Gennemsnitlig hastighed (fig.6a) og forskydning (fig. 6b) er afbildet i en whiskers plot. Prøven viser en stigning i hastighed og forskydning som sammenlignes med styre.

Film

Movie 1. Migration af kontrol celler. Klik her for at se filmen .

Movie 2. Migration af testceller. Klik her for at se filmen .

Kontrol MDA-MB-231 og test MDA-MB-231 celler blev podet tyndt på collagen natten over. Time-lapse video mikroskopi blev udført ved Olympus mikroskop, der er koblet til en EM-Hamamatsu kamera. Billeder taget med et interval på 1 time til 18 timer under tilfældig migrering. Se filmene i tilfældig migration til kontrol og test.

Discussion

Den virkelige tid tilfældige migration analysen muliggør præcis, følsom, analyse af cellemigration parametre såsom hastighed og forskydning. Denne fremgangsmåde er ikke begrænset til slutpunkt måleværdien, og det er derfor mere kvantitativ. Da cellerne overvåges under normal DMEM-medium med serum, og det reducerer den skadelige virkning af længere inkubation i serumfrie medier. Det har vist sig, at migreringen af celler afhænger af formateringen og bryde celle-kontakter med substratet ^8, således kan denne fremgangsmåde anvendes til at studere virkningen af forskellige substrater til migration.

Et af de kritiske trin involverer passende styring af temperaturen til 37 ° C og _CO2 ved 5% for at sikre optimal migration. Assayet tillader fleksibilitet til at overvåge migrerende responser på ønskede tidspunkter, men kan kræve optimering af antallet af tidspunkter. For eksempel kan nogle celler med lavere vandringshastigheder skal overvåges for en longer tid sammenlignet med celler, der har højere vandringshastigheder.

Mikromiljøet af tumoren er en af ​​de afgørende faktorer i carcinogenese. Cancer resultater fra interaktionen af tumorceller med omgivende celler, såsom endotelceller, stromale og inflammatoriske celler ^9. Dette assay kan modificeres til at undersøge, hvordan migrering af tumorceller påvirkes af mikromiljø. En af de måder, hvorpå det kan opnås, er ved at studere migrationen af ​​fluorescensmærkede tumorceller dyrket i en blandet population af forskellige celler, såsom stomi-og endotelceller. Denne fremgangsmåde kan også anvendes til at studere sårheling i realtid.

Time-lapse-mikroskopi kan modificeres til at overvåge celleinvasion, celledeling, apoptose og lamellipodial dynamik og fokal adhæsion dynamik med højere opløsning linser.

En af begrænsningerne ved denne metode er, at den ikke tillader overvågning af migrationtion in vivo. Da der ikke er udstyr til rådighed, som kan måle realtid migration i kroppen, er denne type af assay er ikke egnet til in vivo migration. Det er heller ikke muligt for os at belyse biokemiske maskineri og signalanlæg komponenter, der er vigtige i celle migration. For at løse de signaleringsveje, er det vigtigt at udføre biokemiske forsøg. Se referencer for grupper, som har brugt denne metode til tilfældige migration ^{6, 10-14.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30243.01
FBS	Gemini Bio Products	100-106
Opti-Mem	Invitrogen	31985-070
Collagen	BD Biosciences	354231
Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller	Olympus Corporation	Olympus 1X81
Environmental control chamber	Neue	Neue Live Cell Chamber	Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments.
Automated XY stage	Prior Scientific	Prior Proscan	This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy.
Camera		Hamamatsu EM camera C9100
Software	Typically purchased through microscope vendor such as Olympus	Slide Book 5