Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale
Summary
Processi cellulari come la migrazione delle cellule sono stati tradizionalmente studiati su due dimensioni, superfici in plastica rigida. Questo rapporto descrive una tecnica per la visualizzazione diretta di localizzazione delle proteine e l'analisi dinamica della proteina in cellule di migrare in modo più fisiologicamente rilevanti, matrice tridimensionale.
Abstract
Tradizionalmente, la migrazione delle cellule è stato studiato su due dimensioni, superfici in plastica rigida. Tuttavia, durante importanti processi biologici come la guarigione delle ferite, la rigenerazione dei tessuti, e le metastasi del cancro, le cellule devono navigare attraverso complesse, tridimensionali tessuto extracellulare. Per meglio comprendere i meccanismi alla base di questi processi biologici, è importante esaminare il ruolo delle proteine responsabili per la guida migrazione cellulare. Qui, delineare un protocollo per studiare i meccanismi della migrazione cellulare utilizzando la linea delle cellule epiteliali (MDCK) e una tridimensionale, fibroso, auto-polimerizzazione della matrice come sistema modello. Questa matrice extracellulare otticamente chiaro è facilmente riconducibile a vivere a cellule studi di imaging e meglio imita il fisiologico, l'ambiente dei tessuti molli. Questa relazione dimostra una tecnica per la visualizzazione diretta di localizzazione delle proteine e la dinamica, e la deformazione del circostante matrice tridimensionale.
Esameminazione della localizzazione delle proteine e delle dinamiche durante i processi cellulari fornisce informazioni chiave in funzioni delle proteine. Geneticamente codificato tag fluorescenti di fornire un metodo unico per osservare la localizzazione delle proteine e la dinamica. Utilizzando questa tecnica, possiamo analizzare l'accumulo subcellulare di chiave, la forza che generano componenti del citoscheletro in tempo reale come le manovre cellula attraverso la matrice. Inoltre, utilizzando più tag fluorescenti con diverse lunghezze d'onda, possiamo esaminare la localizzazione delle proteine contemporaneamente, permettendoci così di prova, ad esempio, se diverse proteine hanno ruoli simili o divergenti. Inoltre, la dinamica delle proteine fluorescenti tag può essere quantificata l'utilizzo di recupero dopo photobleaching fluorescenti (FRAP) analisi. Questo test misura la mobilità delle proteine e come stabilmente le proteine sono legati alla rete del citoscheletro.
Grazie alla combinazione di live-cellulare imaging con trattamento di inibitori della funzione della proteina,possiamo esaminare in tempo reale i cambiamenti nella distribuzione delle proteine e della morfologia delle cellule migrano. Inoltre, abbiamo anche combinare live-cell imaging con l'uso di particelle traccianti fluorescenti incorporate nella matrice di visualizzare la matrice di deformazione durante la migrazione cellulare. Quindi, possiamo visualizzare come una cellula migrazione distribuisce la forza che generano le proteine, e dove le forze di trazione sono esercitate alla matrice circostante. Attraverso queste tecniche, siamo in grado di acquisire una conoscenza diretta dei ruoli delle proteine specifiche e il loro contributo ai meccanismi della migrazione cellulare.
Protocol
Discussion
Qui si descrive un metodo per l'utilizzo live-cell imaging per studiare i meccanismi di migrazione delle cellule in una matrice tridimensionale. Il successo di questa tecnica dipende da ottenere "buoni" cloni che esprimono stabilmente GFP-tagged proteine. Il basso livello di proteine GFP richiede un'esposizione eccesso di eccitazione che compromette la salute delle cellule, mentre il livello troppo alto GFP avrà effetti collaterali indesiderati sulla cellula. Così, la scelta vettore per trasfet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il dottor Grant Sumida per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un Premio Giovani Investigator Beckman (SY), una famiglia Hellman New Faculty Award (SY), EUREKA NIH, l'Università della California Cancer Research Coordinating Committee.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen, bovine, Type I | BD Biosciences | 354231 | Stock is about 3 mg/ml |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 281778 | Dilute in water |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | 340855 | Dilute in PBS |
| 1M Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Fluospheres polystyrene microspheres 1 µm, red fluorescence (580/605) | Invitrogen | F13083 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| Culture media components: | |||
| DMEM | Invitrogen | 31600-034 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S115500 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160-054 | |
References
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