Hücre göçü gibi hücresel süreçleri, geleneksel iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu rapor doğrudan protein lokalizasyon görselleştirme ve daha fizyolojik ilgili üç boyutlu bir matris içinde göç eden hücrelerin protein dinamiklerini analiz etmek için bir teknik anlatılmaktadır.
Geleneksel olarak, hücre göçü, iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Ancak, yara iyileşmesi, doku rejenerasyonu ve kanser metastazı gibi önemli biyolojik süreçleri sırasında, hücrelerin karmaşık, üç boyutlu ekstrasellüler doku ile dolaşmak gerekir. Bu biyolojik süreçlerin altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak için, hücre göçü sürüş için sorumlu proteinlerin rollerini incelemek için önemlidir. Burada, epitel hücre hattı (MDCK) kullanarak hücre göç mekanizmaları incelemek için bir protokol taslağı, ve üç boyutlu bir model sistem olarak, lifli, kendi kendine polimerize matris. Bu optik net ekstraselüler matriks, canlı hücre görüntüleme çalışmaları kolayca mükellef ve fizyolojik, yumuşak doku ortamı daha iyi taklit eder. Bu rapor doğrudan protein yerelleştirme ve dinamikleri görselleştirmek için tekniği ve çevresindeki üç boyutlu matris deformasyon gösterir.
Sınavhücresel süreçleri sırasında protein yerelleştirme ve dinamikleri ination protein fonksiyonları önemli bir fikir verir. Genetik olarak kodlanmış olan floresan etiketleri protein yerelleştirme ve dinamikleri gözlemlemek için benzersiz bir yöntem sağlar. Bu tekniği kullanarak, anahtar hücre içi birikimi analiz edebilir, kuvvet üreten matris yoluyla hücre manevraları gibi gerçek zamanlı sitoskeletal bileşenleri. Buna ek olarak, farklı dalga boylarına sahip birden fazla floresan etiketlerini kullanarak, biz, böylece bize farklı proteinler benzer veya birbirinden farklı rollere sahip olup olmadığını, örneğin, test etmek için izin proteinlerin aynı anda birden fazla lokalizasyonu inceleyebilirsiniz. Ayrıca, floresan tagged proteinleri (sıkı bağlamak) analizi Photobleaching sonra Floresan Recovery programını kullanarak dinamikleri belirlenebilir. Bu ölçüm testleri, protein hareketlilik ve nasıl stably proteinler bağlı iskelet ağ.
Canlı hücre görüntüleme protein fonksiyonu inhibitörlerinin tedavi ile birleştirerek,proteinleri ve göç eden hücrelerin morfolojisi dağıtım gerçek zamanlı değişiklikleri inceleyebilirsiniz. Ayrıca, biz de hücre göçü sırasında matris deformasyon görselleştirmek için matris içinde gömülü floresan tracer parçacıkların kullanımı ile canlı hücre görüntüleme birleştirir. Böylece, kuvvet üreten bir göç hücre proteinleri nasıl dağıttığını görselleştirmek, nerede ve çekiş güçleri çevreleyen matriks sarf edilir. Bu teknikler sayesinde, hücre göçü mekanizmaları spesifik proteinlerin ve onların katkılarını rolleri içine değerli bilgiler elde edebilirsiniz.
Burada, üç boyutlu bir matris hücre göçü mekanizmaları çalışma canlı hücre görüntüleme kullanmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu tekniğin başarı stably GFP-etiketli proteinlerin ifade "iyi" klonlar elde bağlıdır. GFP proteinlerin düşük seviyesi çok yüksek, GFP seviyesi hücrede istenmeyen yan etkileri var ise, hücre sağlığını tehlikeye atar aşırı uyarım pozlama gerektirir. Böylece, hücre içine genler transfect vektör seçim (örneğin, organizatörü, floresan e…
The authors have nothing to disclose.
Biz yazının eleştirel okuma Dr. Grant Sumida teşekkür ederim. Bu çalışma, Beckman Genç Araştırmacı Ödülü (SY), Hellman Aile Yeni Fakülte Ödülü (SY), NIH EUREKA, University of California Kanser Araştırma Koordinasyon Komitesi tarafından desteklenmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Collagen, bovine, Type I | BD Biosciences | 354231 | Stock is about 3 mg/ml |
3-aminopropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 281778 | Dilute in water |
glutaraldehyde | Sigma Aldrich | 340855 | Dilute in PBS |
1M Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
Fluospheres polystyrene microspheres 1 µm, red fluorescence (580/605) | Invitrogen | F13083 | |
Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
Culture media components: | |||
DMEM | Invitrogen | 31600-034 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S115500 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Kanamycin | Invitrogen | 15160-054 |